[发明专利]检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法

权利要求书

1.检测地中海贫血基因的引物对和探针，其特征在于：包括β-地中海贫血CD41/42和α-地中海贫血-SEA的两者的引物对及探针；所述的β-地中海贫血CD41/42的引物对为：

HBB上游引物：5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(序列1)；

HBB下游引物：5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(序列2)；

对应的所述的β-地中海贫血CD41/42的探针为：

野生型β-珠蛋白：VIC-CAGAGGTTCTTTGAGTCCT-MGBNFQ(序列3)，

突变CD41/42缺失型：FAM-AGAGGTTGAGTCCTT-MGBNFQ(序列4)；

所述的α-地中海贫血-SEA的引物对为：

HBA上游引物：5’-TCGGTCGTCCCCACTGT-3’(序列5)；

HBA下游引物Ⅰ：5’-GGACTGCTCCGCTCCAC-3’(序列6)；

HBA下游引物Ⅱ：5’-CAGCCTTGAACTCCTGGACTTAA-3’(序列7)；

对应的所述的α-地中海贫血-SEA的探针为：

野生型α-珠蛋白：FAM-TCTAGCCCCTGA GCACCG-MGBNFQ(序列8)；

突变SEA缺失型：VIC-CTCCAAGTGAACCTCC-MGBNFQ(序列9)。

2.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针，其特征在于：所述的HBA下游引物Ⅰ为设计的野生型α-珠蛋白的引物；所述的HBA下游引物Ⅱ为设计的突变SEA缺失型的引物；所述的HBA下游引物Ⅰ与所述的HBA上游引物构成HBA野生型α-珠蛋白的引物对，对应的所述的HBA下游引物Ⅱ与所述的HBA上游引物构成HBA突变SEA缺失型的引物对。

3.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的探针组和引物对，以及其他试剂；所述的其他试剂包括水、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品、阴性参考品和标准品中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1收集包括孕妇外周血浆以及囊胚移植后弃置的囊胚培养基为待检测样品，先将囊胚培养基进行预处理，再分别提取外周血浆和囊胚培养基中的游离DNA；

S2将提取后的DNA按照来源分为血浆中的游离DNA以及囊胚培养基中的游离DNA，采用β-地中海贫血CD41/42的引物对和探针，以血浆的游离DNA以及囊胚培养基的DNA为模板分别进行微滴数字PCR的扩增反应，得到扩增后的产物；

S3将得到的扩增产物进行检测荧光强度，确定基因型；

S4采用α-地中海贫血-SEA的引物对及探针重复上述S2-S3的过程，即为引物对和探针的使用方法。

5.根据权利要求4所述的检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，其特征在于：所述的囊胚培养基的预处理，包括以下步骤：

(1)通过裂解液以及裂解酶进行囊胚培养基的裂解，得到囊胚培养基的裂解产物；(2)利用β-地中海贫血CD41/42的引物对或α-地中海贫血-SEA的引物对进行囊胚培养基裂解产物的预扩增，得到预扩增产物。