[发明专利]检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法

说明书

本发明公开了检测地中海贫血基因的引物对和探针，包括β‑地中海贫血CD41/42和α‑地中海贫血‑SEA的引物对及探针；所述β‑地中海贫血CD41/42的引物对为序列1和序列2，探针为序列3和序列4；所述α‑地中海贫血‑SEA的引物对为序列5和序列6或者序列5和序列7，探针为序列8和序列9；本发明还提供检测地中海贫血基因的引物对和探针的使用方法，包括以下步骤：S1收集样品并提取DNA；S2利用一种引物对和探针进行扩增反应；S3检测荧光强度，确定基因型；S4利用另外一种引物对和探针重复上述过程；本发明的有益效果是：通过设计的引物对及探针，和同种两类引物对，增强荧光检测准确性；通过采提取孕妇血浆和囊胚培养基的游离DNA，实现快速准确无害检测。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体是检测地中海贫血基因的引物对和探针、试剂盒及使用方法。

背景技术

地中海贫血是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，包括α地中海贫血和β地中海还贫血两种。我国以南方地区多见，尤以广东、广西和海南最多，是长江以南各省份发病率最高，影响最大的单基因疾病。我们将研究重点放在最常见的突变上，β-地中海贫血中的β-珠蛋白基因的突变即密码子41/42处的四个核苷酸(–CTTT)缺失，HBB:c.126delcttt(CD41/42)。CD41/42突变在中国广西、广东、海南和四川等地的所有β地中海贫血突变中发病率最高，分别占所有β地中海贫血等位基因的36.4％、42.5％、73.7％和33.33％。α-地中海贫血中的α-珠蛋白的SEA-缺失突变，SEA缺失突变占所有α-地中海贫血突变中的最高比例，约为68.06％。目前地贫尚无有效的治疗方法，重度α地贫儿一般在出生的24～48小时之内死亡，重度β地贫儿和部分中间型α地贫儿在出生后3-6个月开始出现贫血症状并进行性加重，严重者必须依靠输血和联合铁螯合剂的长期治疗，但治疗价格昂贵，而骨髓移植又需要严格的供体，因此目前并没有理想的治疗方法。地中海贫血的防治工作十分重要，故在地贫高发地区对夫妻双方携带同种地贫基因的孕妇进行产前诊断是预防重度患儿出生的首选方法。而地中海贫血的常规产前诊断采用羊膜穿刺术或绒毛膜取样(CVS)，这是有创性的，有一定的宫内感染的风险和0.5-1％的流产风险。胚胎地贫基因的检测基于常规卵裂球活检或囊胚滋养层细胞活检取样获得胚胎DNA，活检取样是有创的，会对胚胎造成一定的细胞损伤。人类胚胎活检的长期安全性还没有完全评估，但动物研究表明胚胎活检可能导致表观遗传修饰改变，对胚胎神经和肾上腺发育产生负面影响，同时还可能影响卵巢功能。如何安全、无创、准确、简便，对胎儿或者胚胎进行早期地贫基因检查一直是一个热点问题。母血浆中胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA)结合二代测序技术的无创产前诊断技术检测胎儿非整倍性已广泛应用于临床。胚胎培养基中存在的胎儿游离DNA性质和母血浆中胎儿游离DNA性质，片段大小接近且均是母体DNA和胎儿DNA的混合物。胚胎培养基中胚胎游离DNA结合二代测序技术无创产前诊断技术检测胚胎的非整倍性已经有大量报道，但是准确性范围波动广，无创产前诊断单基因疾病的报道较少，需要更加灵敏准确的技术进行无创产前诊断单基因疾病的检测。