[发明专利]一种无血清骨髓培养基及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种无血清骨髓培养基，其特征在于，包括基础培养基，

以及加入该基础培养基中的L-抗坏血酸、维生素E、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、亚硒酸钠、谷氨酰胺、rhIL-2、CpG寡聚核苷酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、BSA、甘油磷酸钠、HEPES、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、rhu-EPO培养的人类淋巴细胞培养上清；

所述的基础培养基为RPMI1640培养基；

L-抗坏血酸在基础培养基中的浓度为5-20mg/L；

维生素E在基础培养基中的浓度为5-15mg/L；

青霉素在基础培养基中的浓度为1×10⁵U/L；

链霉素在基础培养基中的浓度为50mg/L；

丙酮酸钠在基础培养基中的浓度为80-120mg/L；

亚硒酸钠在基础培养基中的浓度为10-20nM；

谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为10-30mM；

rhIL-2在基础培养基中的浓度为0.005-0.05mg/L；

CpG寡聚核苷酸在基础培养基中的浓度为0.5-5uM；

亚油酸在基础培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L；

亚麻酸在基础培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L；

硬脂酸在基础培养基中的浓度为5-15uM；

BSA在基础培养基中的浓度为2g-10g/L；

甘油磷酸钠在基础培养基中的浓度为5-15g/L；

HEPES在基础培养基中的浓度为3-6g/L；

NaH₂PO₄在基础培养基中的浓度为1-5g/L；

Na₂HPO₄在基础培养基中的浓度为0.5-1.5g/L；

rhu-EPO培养的人类淋巴细胞培养上清在基础培养基中的浓度为0.5-5mL/L；

rhu-EPO培养的人类淋巴细胞培养上清的制备方法如下：

人类淋巴细胞1×10⁶个/mL接种于含有1~10IU/L rhu-EPO的RPMI1640培养基中，培养3天，收集细胞1500rpm离心10分钟后，收集上清，然后上清液进行4500rpm离心20分钟，收集上清即可；

所述的无血清骨髓培养基中CpG寡聚核苷酸为DSP-30，采用硫代磷酸修饰。

2.根据权利要求1所述的无血清骨髓培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取上述无血清骨髓培养基的各组分，按照各自浓度使用量，加入到基础培养基中充分溶解混匀，然后0.22uM滤膜过滤除菌分装成5ml/瓶，即得。

3.根据权利要求2所述的无血清骨髓培养基的制备方法，其特征在于，

rhu-EPO培养的人类淋巴细胞培养上清的制备方法如下：

人类淋巴细胞1×10⁶个/mL接种于含有1~10IU/L rhu-EPO的RPMI1640培养基中，培养3天，收集细胞1500rpm离心10分钟后，收集上清，然后上清液进行4500rpm离心20分钟，收集上清即可。

4.根据权利要求1所述的无血清骨髓培养基在制备骨髓染色体核型分析试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用的步骤包括：

将骨髓细胞以1.5～2×10⁷个接种到上述的无血清骨髓细胞培养基中，放入37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时或者48小时，终止培养前2小时没加入秋水仙素；收集细胞，低渗、预固定、固定、滴片、烤片老化、胰酶消化、Giemsa染色，然后可进行染色体核型分析。