[发明专利]一种耐热大肠杆菌的创制方法

权利要求书

1.一种耐热大肠杆菌的创制方法，其方法特征在于：包括下列步骤：

(1)将-80冰箱保存的大肠杆菌菌株进行LB固体培养基划板活化，培养至单菌落出现；

(2)将所述单菌落大肠杆菌用液体培养基连续培养2次至对数生长期后，涂布到LB固体培养基培养至单菌落出现；

(3)将上述大肠杆菌置于在紫外灯下照射处理后筛选存活菌株；

(4)将上述紫外诱变存活突变菌株进行不同温度梯度驯化培养；

(5)对存活高温耐受菌株进行液体发酵，观察生长是否正常。

2.根据权利要求1所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的具体操作：将-80℃冰箱中保存的大肠杆菌DH5α取出，在LB固体培养基上划板后，置于37℃培养12-16h至单菌落形成，转至4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的具体操作：挑取固体培养基上的DH5α单菌落转入离心管中，LB液体培养基37℃，振荡培养8-10h至OD₆₀₀＝0.6-0.8，再取新鲜菌液加入LB液体培养基中，于37℃，振荡培养6-8h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后，取新鲜菌液进行LB平板涂布。

4.根据权利要求1所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的具体操作：取步骤(2)中连续两次培养获得的新鲜菌液涂布的LB平板，放置于超净工作台上，开启20W紫外灯照射2min、4min、6min、8min、10min，然后将平板放置于37℃培养，24h后根据增殖情况筛选存活突变菌株。

5.根据权利要求1所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的具体操作：挑取步骤(3)中紫外诱变得到的存活突变单菌落接入LB液体培养基，置于37℃，振荡培养12h-16h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后，取新鲜菌液加入LB液体培养基中，于37℃，振荡过夜培养8h-10h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后LB平板划板，37℃培养至单菌落出现。

6.根据权利要求5所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的具体操作还包括：分别在42℃、45℃和48℃条件下，对得到的单菌落和新鲜菌液重复上述培养过程，进行突变菌株的耐热温度梯度驯化，最后对48℃存活下来的突变耐热菌株培养液添加15％灭菌甘油进行-80℃保存。

7.根据权利要求1所述的一种耐热大肠杆菌的创制方法，其特征在于：所述的步骤(5)中的具体操作：将步骤(4)中-80℃保存耐热突变菌株菌液按1％的接种量接种于LB液体培养基中,37℃静置培养，每隔3h测定1次OD₆₀₀，以时间为横坐标,OD₆₀₀读数为纵坐标，绘制所得耐热菌的生长曲线，判断发酵情况。