[发明专利]一种耐热大肠杆菌的创制方法

说明书

本发明公开一种耐热大肠杆菌的创制方法，其包括：将超低温保存的大肠杆菌甘油菌活化后，接种到LB液体培养基中培养至对数生长期后，菌液涂布到LB固体培养基上生长到单菌落出现，然后置于紫外灯下照射处理，对紫外诱变存活突变菌株进行不同温度梯度驯化，最终获得能正常发酵的耐热大肠杆菌突变菌株。本发明创制出一种能够适应高温环境的大肠杆菌，为微生物工业发酵提供新菌株，具有高效简单且成本低廉等优点。

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体是利用紫外诱变和温度梯度驯化相结合的方法，创制出一种能够耐受高温环境的大肠杆菌，为微生物工业发酵提供新种质。

背景技术

工业微生物发酵制造生物产品的过程中，由于生物代谢热和机械搅拌热累积，常常导致发酵罐不断升温，因微生物无法自行降到代谢最适温度，需要消耗大量冷却水控温，导致能耗费用和生产成本增加。所以提高发酵菌株的耐热性将大幅度降低成本。

微生物诱变育种技术是指用物理、化学因素诱导微生物的遗传物质发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。诱变育种操作简便、突变率高、突变谱广，它不仅能提高产量、改进质量，还可增加产品品种和简化工艺条件。如1943年从自然界分离到的青霉素产生菌的效价只有20单位/ml，经过一系列的诱变育种后，效价达10万单位/ml。大肠杆菌作为目前最常用的模式工业微生物之一，提高其耐热性，获取耐热突变菌株对获得低成本生物制品具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种耐热大肠杆菌的创制方法，以解决现有技术中大肠杆菌在高温环境发酵困难甚至难以存活的问题。参照该方法创制的耐热大肠杆菌可在45℃条件下正常生长，保证产品生产和质量。因此本方法创制的耐热大肠杆菌在发酵工业中有较高的经济价值。

本发明采用的技术方案是提出一种耐热大肠杆菌的创制方法，包括下列步骤：

(1)将-80冰箱保存的大肠杆菌DH5α取出，在LB固体培养基上划板后，置于37℃培养12h-16h，单菌落形成后转至4℃保存；

(2)挑取4℃保存的固体培养基上的单菌落转入15ml离心管中，加入3mlLB液体培养基，置于37℃，180rpm/min振荡培养8-10h至OD₆₀₀＝0.6-0.8，再取20ul新鲜菌液加入20mlLB液体培养基中，于37℃，180rpm/min振荡培养6-8h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后，取200ul新鲜菌液进行LB平板涂布。

(3)取连续两次液体培养获得的新鲜菌液涂布的LB平板，放置于超净工作台台面上，开启20W紫外灯照射10min后，将平板转入37℃培养，24h后计算菌落数，并根据增殖情况筛选存活突变菌株。

(4)挑取上述紫外诱变得到的存活突变单菌落接入3mlLB液体培养基，置于37℃，180rpm/min振荡培养12h-16h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后，取20ul新鲜菌液加入20mlLB液体培养基中，于37℃，180rpm/min过夜培养8h-10h至OD₆₀₀＝0.6-0.8后LB平板划板，37℃培养至单菌落出现。分别在不同温度条件下(42℃→45℃→48℃)，对上一次得到的单菌落和新鲜菌液重复上述培养过程，进行突变菌株的耐热温度梯度驯化。最后对45℃存活下来的突变耐热菌株培养液添加15％灭菌甘油进行-80℃保存。

(5)将-80℃保存耐热突变菌株菌液按1％的接种量接种于LB液体培养基中,37℃静置培养，每隔3h测定1次OD₆₀₀。以时间为横坐标,OD₆₀₀读数为纵坐标，绘制所得耐热菌的生长曲线，判断其能否正常发酵。