[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法

说明书

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明将相应靶基因crRNA在氧化葡萄糖酸杆菌中进行表达。通过验证对质粒上mCherry荧光表达的抑制作用，表明重组氧化葡萄糖酸杆菌有基因抑制的作用，并且通过对氧化葡萄糖酸杆菌基因组中的其他基因进行抑制，也达到了类似的抑制效果，进一步证明了此系统对基因组上基因的抑制功能。为在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制目的基因提供了一种新方法，能够快速、有效抑制目的基因的表达，提高了对氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑效率。

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法，属于基因工程和生物工程技术领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌属是醋酸菌群的一部分，因其能够不完全氧化广泛的碳水化合物和醇类，氧化葡萄糖酸杆菌菌株已被成功应用于食品、医药和化妆品等工业领域，生产如维生素C、米格列醇、二羟基丙酮和葡萄糖酸盐等产品。特别是氧化葡萄糖酸杆菌因能以芳香醇、脂肪醇和5-酮果糖为底物合成调味成分而在食品添加剂和甜味剂的生产中具有重要应用。氧化葡萄糖酸杆菌因没有完整的糖酵解跟柠檬酸循环，其主要的中心碳代谢途径为磷酸戊糖途径与Entner-Doudoroff途径。

随着代谢工程及合成生物学的发展，对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程改造以提升其生产转化能力越来越引起科研工作者的重视。然而，相对于大肠杆菌，酿酒酵母等模式菌株，作为工业菌株的氧化葡萄糖酸杆菌可用的基因操作工具非常有限。目前，仅有少数的穿梭质粒可用，且这些质粒在同一氧化葡萄糖酸杆菌内通常不兼容，限制了质粒游离表达多个基因的可能性。同时，对于氧化葡萄糖酸杆菌基因组的操作工具通常依赖于抗性整合跟利用五氟尿嘧啶反选整合的方法。因氧化葡萄糖酸杆菌对于多种抗生素的天然抗性，抗性整合被严重制约。另外因利用五氟尿嘧啶反选假阳性极多，大大增加了工作量。

因此，需要找到一种能够高效、简便的抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，从而推动对于氧化葡萄糖酸杆菌的研究与应用。

发明内容

为了解决目前存在的问题，本发明通过转化能够转录crRNA的p2-5-p_Atse-crRNA(图1)，实现了对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因的抑制，成功在氧化葡萄糖酸杆菌中开发出了基于IE型CRISPR-Cas系统的CRISPRi系统，扩展了氧化葡萄糖酸杆菌中可应用的基因操作工具。

本发明的第一个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的元件，所述元件由crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成。

在本发明的一种实施方式中，crRNA由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。

在本发明的一种实施方式中，以p2-5载体为表达载体，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子为任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中表达的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子包括p_Atse。

在本发明的一种实施方式中，所述p_Atse的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。

本发明的第二个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，利用所述的元件抑制基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述基因包括红色荧光蛋白、Entner-Doudoroff途径关键基因edd和磷酸戊糖途径关键基因gnd。

在本发明的一种实施方式中，所述edd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。