[发明专利]一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)载体设计和构建、体外转录

(1-1)根据基因信息及实验要求，设计gRNA和Donor Oligo的序列；

步骤(1-1)中的基因信息如下：

(1-1-1)小鼠的ITGA2B基因gene位于小鼠的11号染色体上；

(1-1-2)步骤(1-1-1)的基因共具有30个外显子，起始密码子ATG位于1号外显子，终止密码子TGA位于30号外显子，Q887位于26号外显子；

(1-1-3)选择外显子26为靶向位点；

步骤(1)中的gRNA靶向序列如下：

gRNA1：ATGCCTGTCTGCGCTCACGCTGG；

gRNA2：GCCCTGGCTTGGGCCCCTGCAGG；

步骤(1-1)中，Donor Oligo序列如下：

供者寡核苷酸序列1：

GGTGGACTGGAAACTATCCACGCCCAGCCCTTCTTCCATTCGCCCCGTCCATCACCAACGTGAGCGCAGATAG；

其中，CAA为沉默突变，TAG为突变序列；

GCATTCCTGCAGGGGCCCAAGCCAGGGCAGCAGGACCCAGTTCTGG TGGTGAGAAGGCTC；

供者寡核苷酸序列2：

AAACTATCCACGCCCAGCCCTTCTTCCATTCGCCCCGTCCATCACCAGCGTGAGCGCAGATAGGCATTCTTAC；

其中，TAG为突变序列，TTA为沉默突变；

(1-2)合成Donor Oligo，构建gRNA载体；

步骤(1-2)的具体步骤为：

(1-2-1)设计靶向载体和供者寡核甘酸的gRNA，左右侧翼分别结合130bp或120bp的同源序列；

(1-2-2)供者寡核苷酸的Q887X突变位点通过同源配对引进26号外显子；同时引进一个无义突变来防止同源配对后gRNA结合并重新切割序列

(1-3)将gRNA载体和Cas9载体进行体外转录；

(2)显微注射及F0代鼠的鉴定

(2-1)将步骤(1)得到的gRNA和Cas9 mRNA与Donor Oligo共注射到受精卵；

(2-2)将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；

(2-3)鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析，获得阳性F0鼠；

(3)F1代鼠的繁殖和鉴定

将步骤(2)中性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，最终提供至少3只经PCR和测序验证的F1代点突变GT小鼠模型；

(4)冷冻保种。