[发明专利]一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：(1)载体设计和构建、体外转录：(1‑1)根据基因信息及实验要求，设计gRNA和Donor Oligo的序列；(1‑2)合成Donor Oligo，构建gRNA载体；(1‑3)将gRNA载体和Cas9载体进行体外转录；(2)显微注射及F0代鼠的鉴定；(3)F1代鼠的繁殖和鉴定：将步骤(2)中性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，最终提供至少3只经PCR和测序验证的F1代点突变GT小鼠模型；(4)冷冻保种。本发明首次用CRISPR/Cas9技术精准编辑构建点突变血小板无力症小鼠模型，该模型精准编辑小鼠的基因，比以往通过抗体注射诱导或者基因敲除技术构建的GT小鼠模型更为精准。为深入研究GT的发病机制及探索新的治疗方法提供了很好的模型。

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法。

背景技术

血小板无力症(Glanzmann’s thrombasthenia,GT)是一种单基因遗传病。17号染色体的ITGA2B或ITGB3基因缺陷是其致病原因。当ITGA2B或ITGB3发生突变，血小板膜表面糖蛋白αIIbβ3则出现质或量的异常，使血小板聚集功能异常，引起出血。目前，通过抗体注射诱导或者基因敲除技术构建的GT小鼠模型，不能精准编辑小鼠的基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法，能够精准编辑小鼠的基因，为深入研究GT的发病机制及探索新的治疗方法提供了很好的小鼠模型。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种点突变血小板无力症小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)载体设计和构建、体外转录

(1-1)根据基因信息及实验要求，设计gRNA和Donor Oligo的序列；

(1-2)合成Donor Oligo，构建gRNA载体；

(1-3)将gRNA载体和Cas9载体进行体外转录；

(2)显微注射及F0代鼠的鉴定

(2-1)将步骤(1)得到的gRNA和Cas9 mRNA与Donor Oligo共注射到受精卵；

(2-2)将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；

(2-3)鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析，获得阳性F0鼠；

(3)F1代鼠的繁殖和鉴定

将步骤(2)中性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，最终提供至少3只经PCR和测序验证的F1代点突变GT小鼠模型；

(4)冷冻保种。

其中，步骤(1-1)中的基因信息如下：

(1-1-1)小鼠的ITGA2B基因gene位于小鼠的11号染色体上(GenBank accessionnumber:NM_010575.2；Ensembl:ENSMUSG00000034664)；

(1-1-2)步骤(1-1-1)的基因共具有30个外显子，起始密码子ATG位于1号外显子，终止密码子TGA位于30号外显子，Q887位于26号外显子；

(1-1-3)选择外显子26为靶向位点。

其中，步骤(1-2)的具体步骤为：

(1-2-1)设计靶向载体和供者寡核甘酸的gRNA，左右侧翼分别结合130bp或120bp的同源序列；