[发明专利]番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法

说明书

本发明提供了一种通过沉默miR394来提高番茄晚疫病抗性的长链非编码RNA‑lncRNA40787，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；提供了该长链非编码RNA的克隆方法：以野生型感晚疫病番茄早粉2号的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物与pMD‑18T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序：还提供了该长链非编码RNA的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染，即在番茄中瞬时过表达所述番茄抗晚疫病的长链非编码RNA‑lncRNA40787。本发明得到的长链非编码RNA在番茄瞬时过表达后，番茄miR394的表达量显著降低，其抗晚疫病效果更优：其用于沉默miR394使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种，从而提高番茄产量具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法。

背景技术

番茄是番茄属的草本植物，是世界范围内广泛种植的重要经济园艺作物。含丰富的番茄红素、维生素等，具有极高的营养价值。但在其生长过程中经常遭受着多种病原物的侵害，给番茄生产造成巨大的经济损失。其中，由致病疫霉导致的晚疫病，是一种毁灭性的病害，在番茄的各个阶段均产生了恶劣影响，发病严重时导致番茄茎部腐烂，植株萎蔫，最终导致番茄严重减产。目前防治方法存在环境污染、农药残留、效率低、病菌遗传结构改变的问题。通过分子生物学手段发现抗病基因来抵御病原菌侵染，是增强番茄对晚疫病抗性的一种经济有效的方法。

非编码RNA是一类在转录组中不编码蛋白的RNA，包括管家型RNA及调控型RNA两类，其中调控型RNA被认为是关键调控RNA分子。长链非编码RNA(LncRNAs)作为一种长度大于200nt的调控型RNA存在，通过染色质重塑，转录及转录后调控参与植物生命进程。LncRNAs在小麦白粉病、拟南芥尖刀镰胞杆菌，番茄黄化曲叶病毒等多种抗病过程中均有参与。近年来的研究发现lncRNAs在调控植物抗病过程中，与microRNA (miRNA)间存在着相互作用的关系。LncRNAs可作为miRNA的竞争性内源RNA (competing endogenous,ceRNA)也可以被miRNA靶向并剪切，lncRNAs也可以作为 miRNA的前体产生miRNA。在玉米中通过共表达网络发现了86个可以与miRNA共同作用的lncRNA。拟南芥中的LncRNA-IPS1可作为ceRNA沉默miR399，进而调控生物过程。

MiRNA作为一类长约20-24nt内源单链小分子RNA,是另一种发挥重要生物学功能的调控型RNA。MiR394作为一种高度保守的miRNA，广泛存在于水稻、番茄、玉米等多种植物中，在植株对生物胁迫的响应中扮演关键角色。在番茄感染灰霉病后，植株体内 miR394呈现上调趋势，其靶基因LEAF CURLING RESPONSIVENESS(LCR)表达量下降；在尖孢镰刀菌侵染的大蒜中也得到了相似的结果，miR394表达量上调，靶向LCR，参与了茉莉酸信号通路；miR394在棉花抗曲叶病中也可影响相关致病基因的存在。miR394 与三个包含其前体序列的lncRNAs呈现差异表达，响应了油菜核盘菌的感染。说明miR394 在介导真菌病原体的应答过程中，lncRNA也参与其中，但二者间具体关系及调控方式还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于开发一种番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆的方法；并提供该基因在沉默miR394及增强番茄对晚疫病抗性中的应用方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787，其序列如SEQ ID NO.1所示。