[发明专利]一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法

权利要求书

1.一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.1所示的PFKFB4序列构建到表达载体pET28a上得到含有PFKFB4的重组质粒pET28a-PFKFB4；

(2)将pET28a-PFKFB4导入到大肠杆菌BL21中得到PFKFB4的表达菌株；

(3)在合适温度下，IPTG诱导表达菌株表达，集菌，破碎，使用His标签的亲和层析纯化得到高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4PFKFB4。

2.根据权利要求1所示的高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述的重组载体pET28a-PFKFB4通过如下步骤的方法制备：将如SEQ ID NO.1所示的PFKFB4序列合成克隆到载体pU19中，获得pU19-PFKFB4；以pU19-PFKFB4为模板，使用PFKFB4上游引物和下游引物扩增PFKFB4；通过上下游引物上的酶切位点EcoR I、Hind III将PFKFB4和6个His标签构建到载体pET28a上，得到pET28a-PFKFB4重组质粒。

3.根据权利要求1所示的高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，PFKFB4上游引物为5’-CGCGAATTCATGGCGTCCCCACGGGAA-3’；下游引物为5’-CGCAAGCTTTCATCAGTGATGGTGATGGTGATGCTGGTGAGAGGCACC-3’。

4.根据权利要求1所示的高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，步骤(3)中所述的诱导条件为：诱导前菌液浓度OD₆₀₀为0.8，IPTG浓度为0.3mM，诱导温度为16℃，诱导时间为24小时。

5.根据权利要求1所示的高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，步骤(3)中所述的纯化步骤为：His亲和层析柱的再生；将收集诱导表达后的菌体，使用裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心，取上清上样于再生的His亲和层析柱，使用50mM咪唑选脱液洗杂蛋白，使用250mM咪唑洗脱液洗目的蛋白。

6.根据权利要求5所示的高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法，其特征在于，His亲和层析柱的再生，冲洗顺序为：EDTA洗脱液2CV，ddH₂O 2CV，0.5M NaOH 2CV浸泡30min，ddH₂O 5CV，0.1M NiSO₄ 2CV，ddH₂O 2CV。