[发明专利]一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4的生物合成方法

说明书

本发明提供了一种获得高纯度的6‑磷酸果糖‑2‑激酶4(PFKFB4)的生物合成方法，属于生物技术应用领域。本发明方法包括如下步骤：将如SEQ ID NO.1所示的序列构建到pET28a载体上得到pET28a‑PFKFB4重组质粒，将重组质粒导入BL21大肠杆菌中，合适温度下，IPTG诱导表达，经His亲和层析得到高纯度6‑磷酸果糖‑2‑激酶4。本发明通过筛选表达载体、优化表达条件，获得的PFKFB4纯度可达到90％以上。

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，具体涉及一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4(PFKFB4)的生物合成方法。

背景技术

细胞代谢改变是肿瘤细胞异于正常细胞的重要特征之一，这种代谢异常的依赖性也为特异性杀灭肿瘤细胞提供了一个生化基础。近年，随着对肿瘤代谢分子生物学基础研究的深入，越来越多的证据表明，肿瘤相关基因、细胞微环境、转录因子、非编码RNA以及代谢酶自身的突变或代谢调控蛋白的活性变化，均可导致肿瘤细胞的代谢程序重编，使肿瘤细胞具有特征性的代谢模式，葡萄糖代谢异常就是其中之一。研究表明肿瘤细胞代谢的改变与肿瘤发生发展的过程密不可分。为此，开展肿瘤代谢异常的分子机制研究，寻找有效的分子靶点，对于完善肿瘤发生发展的机制，探索早期诊断的手段、寻找新型抗肿瘤药物，具有重要的理论意义和指导临床实践的价值。

6-磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase，简称PFK)是糖酵解途径中的关键调控酶。PFK在哺乳动物细胞中以两种形式存在，分别为催化果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-二磷酸的I型PFK(简称PFK-1)和双功能可逆催化果糖-6-磷酸生成果糖-2,6-二磷酸II型PFK(6-磷酸果糖-2-激酶，简称PFKFB)。在癌细胞系和原发性肿瘤组织中，PFK-1受致癌基因Ras和Src激活，其活性较正常组织显著增强。而PFK-1活性的增强一定程度上满足了肿瘤细胞对增加糖酵解的高需求，这也使得限速酶PFK-1成为控制肿瘤转化的一个基本节点。

21世纪初，Minchenko等研究人员指出PFKFB4(6-磷酸果糖-2-激酶4)受缺氧诱导，在肺癌、乳腺癌和结肠癌细胞中过量表达。2010年，美国的一项专利指出使用siRNA选择性抑制PFKFB4可以抑制无胸腺小鼠中人肺癌异种移植物的生长，首次报道了PFKFB4家族成员可用于抑制肿瘤代谢和生长的功能。2012年，Ros和Goidts两个独立的课题组分别报告了对癌细胞生存至关重要的基因的无偏差筛查结果，结果表明PFKFB4是胶质瘤细胞和前列腺癌细胞存活所必需的，却不是正常细胞所必需的。这些研究表明PFKFB4同样可能是抗肿瘤剂开发的潜在分子靶标。Ros课题组还发现PFKFB4的FBPase-2是限制糖酵解活性和转移NADPH产生代谢物所不可或缺的，在肿瘤发生发展中同样起着重要的作用。PFKFB4较PFKFB3而言具有更为均衡的PFK-2与FBPase-2活性比例，以PFKFB4为靶标研究PFKFB抑制剂及其调控机制，在关注PFK-2产生FDP的同时也能考虑到FBPase-2的生理功能，因此将更具有代表性。

因此如何获得高纯度高效的6-磷酸果糖-2-激酶4(PFKFB4)，是我们以PFKFB4为靶标研究PFKFB抑制剂的一个重要前提和首要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4(PFKFB4)的生物合成方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种获得高纯度的6-磷酸果糖-2-激酶4(PFKFB4)的生物合成方法，包括以下步骤：

(1)将如SEQ ID NO.1所示的PFKFB4序列构建到表达载体pET28a上得到含有PFKFB4的重组质粒pET28a-PFKFB4；

(2)将pET28a-PFKFB4导入到大肠杆菌BL21中得到PFKFB4的表达菌株；