[发明专利]一种恒温扩增的测序方法

权利要求书

1.一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包括以下步骤，

微球与扩增模板形成混合溶液，所述的微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；

解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；

加入剪切试剂，将含有修饰的引物扩增出来的模板剪切为两段；

加入封端试剂，将微球表面的DNA的3’端进行封堵；

利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；

杂交测序引物；

测序；

其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；

所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。

3.一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包含以下步骤，

高分子微球与扩增模板形成混合溶液，所述的高分子微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；

利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；

杂交测序引物；

测序；

其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；

所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为恒温扩增。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增中的一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述RPA扩增的时间为5-90分钟。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增引物的长度为20-45bp。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述微球的直径为0.3-5微米，优选0.5-4微米，更优选1-2微米。

10.一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50-1000bp的片段，作为扩增模板，按照权利要求1-9任一项所述的方法测序。