[发明专利]一种恒温扩增的测序方法

说明书

本申请公开了一种恒温扩增的测序方法。基于修饰了两种引物微球的、可以试管内发生的恒温扩增反应。本发明的目的是提供一种快速高效、不需要特殊、复杂的建库流程、不需要单独的扩增仪器且与荧光发生等测序方法兼容的试管内进行的恒温扩增技术，通过建好的文库在微球表面的扩增，并将微球固载到基因测序芯片中用于测序。

技术领域

本发明涉及一种恒温扩增的测序方法，属于基因测序领域。

背景技术

高通量测序技术是目前生命科学领域常见的分析技术之一，该技术可以将DNA样本片段进行测序，得到对应样本的DNA序列，建立生物表型与基因组、转录组等层面上的联系。现在，第二代测序技术因为其巨大的通量和相对廉价的价格，已经占据了测序领域的绝大部分市场。第二代测序技术的一大特点就是不是对单独的一条DNA进行测序，而是将一条DNA进行扩增几千几万倍后再进行测序和信号采集，而这其中就要用到不同的DNA扩增技术。目前当今世界上的主流测序技术都有着自己对应的特有的扩增技术。Illumina公司可逆末端终止测序技术使用了桥式扩增方法：在平面芯片表面种植两种不同引物后进行桥式PCR并得到DNA簇；ion torrent公司的半导体测序方法对应的是乳液PCR的扩增方法：在形成的乳液内的微球上进行固相PCR，之后再固载到芯片上；华大测序仪则是使用的DNA纳米球的扩增方式：将DNA固载到芯片表面后扩增成一团DNA纳米球。但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，要么需要额外的复杂仪器单独进行扩增。

本发明阐述了一种基于固载了两种引物微球的、与荧光发生测序兼容的试管内的恒温扩增方法。本发明的目的是提供一种快速高效、不需要特殊、复杂的建库流程、不需要单独的扩增仪器且与荧光发生测序兼容的试管内进行的恒温扩增技术，通过本发明荧光发生测序技术可以将建好的文库在微球表面扩增，并将微球固载到测序芯片上进行测序分析。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种恒温扩增的测序方法，在试管等环境中进行恒温扩增，然后将微球固载到芯片上进行测序。

为实现上述目的，本发明采取下述方案：

本发明公开一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包括以下步骤，

微球与扩增模板形成混合溶液，所述的微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；

解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；

加入剪切试剂，将含有修饰的引物扩增出来的模板剪切为两段；

加入封端试剂，将微球表面的DNA的3’端进行封堵；

利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；

杂交测序引物；

测序；

其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；

所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。

根据优选的实施方式，其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。