[发明专利]一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括：

获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述barcode序列为7-24bp的barcode序列，优选为12-18bp的barcode序列，和/或，所述串联接头序列为2-10bp串联接头序列，优选为2-8bp的串联接头序列，更优选为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的串联接头序列。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述串联处理为对于微生物的全长扩增产物先通过USER酶切处理，得到含有粘性末端的酶切产物，纯化后再通过T4连接酶对所述酶切产物进行串联、纯化得到串联产物。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述USER酶切处理的反应体系为：

扩增产物2～3μg、10×CutSmart buffer 4～6μL、USER Enzyme 2.5～3.5μL，余量为ddH₂O补足50μL，和/或，

所述USER酶切处理的反应条件为在36～38℃下反应30～60min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物为对多个待测样品进行扩增得到所有微生物16S全长的扩增产物，对所有待测样品进行检测去除低质量扩增产物，所述低质量扩增产物为琼脂糖凝胶电泳结果中未出现目的条带或非特异性条带亮度超过目标条带的扩增产物。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述对多个待测样品进行扩增的扩增体系中使用的DNA聚合酶为KOD FX Neo和Hot Start High-Fidelity DNAPolymerase；所述KOD FX Neo和Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase的用量优选与所述扩增体系的体积比为0.3～0.5∶20和0.4～0.6∶20。

7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述建库包括：将所述串联产物浓缩至25～35μL进行切胶片筛并纯化，再进行DNA损伤修复、连接SMRT接头和纯化。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述切胶片筛为筛选长度范围在2-6个微生物16S全长的串联产物。

9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法，其特征在于，在所述建库后还包括：

对文库进行2100检测，当检测结果中文库大小的主峰在3K以上，且文库浓度15ng/μL时，判断为合格的文库。

10.权利要求1-9任一项所述的构建方法在提高三代测序效率中的应用。