[发明专利]一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，所述构建方法为：获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。本发明主要改进三代测序的建库流程，通过将微生物16S全长的扩增产物串联处理，得到含有多个微生物16S序列的扩增子，相较于串联处理前，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本，有效CCS数提高了一倍以上，为三代全长微生物多样性在科研领域的大规模应用起到了催化作用。

技术领域

本发明涉及三代测序技术领域，尤其涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用。

背景技术

微生物群落结构多样性一直是现有技术研究的热点，微生物“个头小，本领强”，从人体的皮肤、口腔、胸腔、阴道到肠道、粪便，无处不在，又称为“人体第二基因组”，在人体中发挥着巨大的作用。还广泛存在于土壤、水体、发酵液、植物、空气等环境样本中，它们推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。

传统研究中，是将环境样本中的微生物进行分离培养，提取已经分离培养出来的每一个纯菌的DNA，针对原核微生物的“身份证”16S rDNA区设计特异性的引物(细菌：27F和1492R)进行一代Sanger测序，通过得到的16S全长从而进行菌种鉴定，然后进行物种多样性的统计。一代测序的弊端是只能针对环境样本中可分离培养的菌进行微生物多样性的分析，不能检测出不可培养的微生物，通量低。随着高通量测序技术的发展，Illumina测序技术兴起，Illumina测序平台有读长的限制，二代微生物多样性测序一般使用PE250或PE300双端测序，因此只能针对细菌16S rDNA的某一段可变区(如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，等)进行测序。提取环境样本中总的微生物DNA，设计特异性引物进行扩增，混样建库测序，可得到环境样本中可培养和不可培养微生物的物种多样性，但是通过某一两个可变区域预测物种的多样性，还是存在一定的误差，一般只能承诺注释到“属”水平。并且对引物特异性要求非常高，不同的样本以及不同的物种对不同的引物都会有偏好性。

因此，现有技术中多个公司推出Pacbio三代全长微生物多样性产品，Pacbio全长微生物多样性测序技术结合了一代Sanger测序的读长优势和Illumina测序的高通量优势，将细菌16S全长完全测通，在细菌群落结构分析中具有：覆盖度广、读长长、通量高、物种注释准，承诺注释到“种”水平，种水平注平均注释率≥60％等产品优势。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，具体通过串联微生物16S扩增子进行建库，应用于三代测序时，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本。

第一方面，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，包括：

获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。

现有技术中，Pacbio测序过程中，芯片上的每个检测单元ZMW孔通常对应一个扩增子分子，本发明通过串联处理将多个微生物16S全长的扩增产物连接成一个扩增子，使得每个检测单元ZMW孔可以一次完成多个微生物16S全长分子的测序，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本。

进一步地，所述barcode序列为7-24bp的barcode序列，优选为12-18bp的barcode序列，barcode序列为测序时为每个微生物16S区域连接的条形码序列，用于和其他微生物16S区域的测序结果进行区分。