[发明专利]超级细菌耐药基因NDM-1的RPA检测引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了超级细菌耐药基因NDM‑1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。涉及分子生物学技术领域。包括1对引物和1个探针，并提供了检测试剂盒和非诊断治疗的检测方法和引物组的应用。本发明仅需具备温控功能的荧光检测仪器，可在39℃条件下对NDM‑1进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及超级细菌耐药基因NDM-1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

背景技术

新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)不是一种细菌，而是编码金属-β-内酰胺酶的一种基因，因首先在印度首都新德里出现而命名。NDM-1基因长度约800bp，位于1个长度约140 000bp的质粒上，可在不同菌株间扩散。NDM-1具有超强的水解作用，几乎能抵抗目前所有抗生素，对人类的健康构成威胁，给临床治疗带来巨大挑战。对于携带NDM-1基因的超级细菌的实验室诊断主要是常规PCR、Sanger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法。这些技术有的耗时耗力，有的灵敏度低，有的需要借助于大型精密仪器。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右；此方法与常规PCR、San ger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法相比，不需要复杂的仪器、耗时短、灵敏度高。目前，内外应用该技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，还没有针对NDM-1的RPA检测方法。

因此，如何提供一种检测超级细菌耐药基因NDM-1的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了超级细菌耐药基因NDM-1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

检测原理:重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是模拟细菌胞内核酸的自我复制所研究出的快速扩增体系，是一种借助多种酶打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3'末端，开始链的延伸，形成新的DNA互补链。同时当双链DNA被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中。在新生成的DNA双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的四氢呋喃位点出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，每打开一条DNA双链就能释放一个荧光基团，荧光信号强度与合成的DNA双链正相关，通过荧光检测仪器可视化。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。需要注意的是与PCR引物不同，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基；且在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素；RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要自己摸索条件进行优化。

本发明验证了检测的灵敏度和特异性，并成功检测了待检株中的NDM-1核酸。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种超级细菌耐药基因NDM-1的RPA检测引物组，包括1对引物和1个探针，引物和探针如下：

NDM-1-F1：5’-CCGCCAGCTCGCACCGAATGTCTGGCAGCACACTT-3’，SEQ ID NO1；