[发明专利]牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开一种用于检测牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法。本发明的试剂盒包括：包被有GTPV‑ORF117编码的抗原蛋白的酶标板，竞争抗体，酶标二抗，样品稀释液，洗涤液，显色底物，及终止液等。本发明的检测试剂盒制备方法是：以提取的山羊痘病毒GTPV基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQIDNo.2为引物扩增得到ORF117胞外区扩增片段，将扩增片段构建到原核表达载体pET‑30a中，表达质粒转化BL21(DE3)感受态，诱导表达获得ORF117胞外区重组蛋白，并将其包被于酶标板上封闭；以ORF117胞外区重组蛋白免疫兔，收集抗ORF117蛋白兔血清制备竞争抗体。本发明具有制备方便，价格低廉，不影响诊断的效率，诊断制剂成本低的优点，可以满足我国现阶段LSD感染、爆发、防控的需求。

技术领域

本发明涉及一种动物传染病检测试剂盒及制备方法，确切讲本发明涉及一 种用于检测牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease, LSD) 也称为牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科、山羊痘病毒属的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skindisease virus,LSDV) 引起的以患牛发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病。该病又称结节性皮炎或块状皮肤病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。临床急需开发一种研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂盒。

目前该病病原的检测方法很多，包括病毒的分离及鉴定、PCR分子检测、 病毒中和试验、免疫荧光、电镜分析等，这些方法具有操作复杂、费用高、需 要生物安全实验室等，不能大范围在基层推广等缺点，很难在现场进行该病的 流行病学调查与监测。而血清学抗体检测试剂盒目前国内还没有，但我国主要 采取疫苗免疫与扑杀相结合的防控策略，血清学抗体检测成为自然感染监测和 疫苗免疫效果评价的关键技术所在。

国外试剂盒(ID Screen Capripox Double Antigen Multi-species，公司ID.vet， 法国)是双一种抗原夹心ELISA，经相关实验表明，该试剂盒的阳性率较低， 仅为35.14％。

现阶段，寻找一种简便快捷、能大范围推广、对所有感染该病的牛都能进 行检测的血清学方法显的尤为重要。

发明内容

本发明提供一种用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒及制备方法。

本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内包括：包被有 GTPV-ORF117编码的抗原蛋白的酶标板、竞争抗体、酶标二抗、及显色底物。

优选地，本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内，GTPV-ORF117 编码的抗原蛋白为重组蛋白，所述的竞争抗体为抗GTPV-ORF117多克隆抗体； 所述的酶标二抗为以HRP标记的鼠抗兔抗体。

优选地，本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内，还有样品稀 释液、其中含有吐温的磷酸缓冲液、酶底物TMB和终止液的2M硫酸。试剂盒 内设置这些物品可大大方便检测作业。

本发明的牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒制备方法是，以提 取的山羊痘病毒GTPV基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1和SEQIDNo.2为 引物扩增得到ORF117胞外区片段，将扩增片段酶切构建到pET-30a原核表达载 体中，转化BL21(DE3)感受态，诱导表达制备ORF117胞外区蛋白并包被于 酶标板上，封闭；以制备的pET-30-ORF117蛋白免疫兔子，收集抗ORF117蛋 白兔血清制备竞争抗体，以鼠抗兔HRP标记的抗体为酶标二抗。