[发明专利]一种去核糖体RNA测序文库的构建方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种去核糖体RNA测序文库的构建方法及试剂盒，涉及生物技术领域。所述方法包括以下步骤：1)Total RNA的打断及核糖体RNA的快速杂交及RNA模板1st strand cDNA的合成；2)2nd strand cDNA的合成；3)双链cDNA 3’末端加A，接头连接；4)去除含dUTP的模板链、文库扩增。本发明采用特殊的rRNA depletion探针，实现一步法快速进行rRNA去除，并完成文库的构建，在rRNA depletion文库构建中大大减少操作步骤，缩短反应时间。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种去核糖体RNA测序文库的测序文库的构建方法及试剂盒。

背景技术

RNA-seq中核糖体RNA去除主要包含三种方法，第一种是通过oligo dT磁珠进行polyARNA捕获；第二种是通过酶解法进行rRNA去除；第三种方法是通过链霉素磁珠法进行rRNA去除；这三种方法或者是在操作过程上比较繁琐，或者是在反应时间上较为冗长，尤其是oligo dT磁珠进行polyA RNA捕获对 RNA样本的质量要求较高。

因此有必要研究一种快速进行rRNA去除、并完成文库的构建的方法，实现减少操作步骤，缩短反应时间，更好地推广应用。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提出一种去核糖体RNA测序文库的构建方法及试剂盒，实现一步法快速进行rRNA去除，以达到有效的简化建库流程的目的。

为了达到上述目的，本发明提出一种去核糖体RNA测序文库的构建方法，包括以下步骤：

1.将total RNA片段化，然后将rRNA与anti rRNA探针进行杂交，形成rRNA 与单链DNA的杂交链；通过随机引物对未被杂交的RNA模板进行链特异性的逆转录形成1st cDNA，形成RNA与1st cDNA的杂交链；所述anti rRNA探针中间经dU修饰；

2.分别将S1中的rRNA链和RNA模板置换成含dUTP的2nd cDNA，均形成双链cDNA；

3.进行末端修复并在3’末端加A，两端连接高通量测序专用的接头；

4.去除含dUTP的模板链，进行文库的PCR扩增，经磁珠纯化得到测序文库。

进一步地，所述Anti rRNA的两个末端进行封闭修饰；优选地，所述Anti rRNA的5’端封闭修饰为氨基修饰，3’端封闭修饰为C6 Spacer修饰、C3 Spacer 修饰或氨基修饰加C6Spacer修饰。

进一步地，所述Anti rRNA探针长度小于100bp。

进一步地，所述Total RNA通过Mg²⁺将RNA进行片段化，所述RNA片段化的反应体系包含Tris-HCl，KCl。

进一步地，所述步骤2中所述逆转录过程的反应体系包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物、放线菌素D。

进一步地，所述步骤4用UDG酶去除含dUTP的模板链。

本发明另一个目的在于，提供一种去核糖体RNA建库试剂盒，其特征在于，包括以上所述去核糖体RNA测序文库的构建方法中的探针。

进一步地，所述试剂盒还包括纯化磁珠，Index Primer和RNA建库体系；所述纯化磁珠为Agencourt AMPure XP beads；所述Index Primer为ABclonal RK20351；所述RNA建库体系为ABclonal RK20301、ABclonaRK20304或 ABclonal RK20353加ABclona RK20222。

相比现有技术，本发明的有益效果为：