[发明专利]一种检测金黄色葡萄球菌的新方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于组合特征肽的靶向分析检测金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌及肠毒素的组合特征肽选自下组：

I1(AYLAVPAAPK)

I2(DYNSPTLIGWVK)

I3(SQSYGQGSDQIR)

I4(AFAQLVTK)

I5(AGYTVNNTPK)

I6(SISSGYTSGR)

I7(DFVNALPTLPDSK)

I8(NLVSEVTDAVEK)

I9(NITQDQDIHAVPK)

SEA1(YNLYNSDVFDGK)

SEA2(SELQGTALGNLK)

SEB1(VLYDDNHVSAINVK)

SEB2(VTAQELDYLTR) 。

2.如权利要求1所述金黄色葡萄球菌组合特征肽，其特征在于，I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9中特征肽阳性检出≥3条，则视为金黄色葡萄球菌阳性。

3.如权利要求1所述金黄色葡萄球菌组肠毒素特征肽，其特征在于，SEA1、SEA2特征肽的阳性检出≥1条，则视为金黄色葡萄球菌肠毒素A阳性；SEB1、SEB2特征肽的阳性检出≥1条，则视为金黄色葡萄球菌肠毒素B阳性。

4.如权利要求1所述的靶向分析检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用系统对金黄色葡萄球菌及肠毒素的组合特征肽进行检测；优选地，采用LC-ESI/QQQ MRM模式进行检测。

5.一种基于组合特征肽的金黄色葡萄球菌及肠毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1中所述的金黄色葡萄球菌及肠毒素的组合特征肽。

6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括金黄色葡萄球菌免疫亲和磁珠(A)、增菌液(B)、生理盐水(C)、Buffer 1(D)、Buffer 2(E)、胰蛋白酶(F)、甲酸(G)；所述金黄色葡萄球菌免疫亲和磁珠(A)上包被有金黄色葡萄球菌抗体；所述Buffer 1(D)为含10mM二硫苏糖醇的50mM碳酸氢铵溶液；所述Buffer 2(E)为含0.5M碘乙酰胺的50mM碳酸氢铵溶液；所述胰蛋白酶(F)的酶浓度为2mg/ml，比活力≥3800u/mg。

7.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：

(1)金黄色葡萄球菌的富集：将待测样品溶解于水中，用金黄色葡萄球菌免疫亲和磁珠(A)抓取金黄色葡萄球菌反应30min，取0.5ml增菌液(B)将免疫磁珠-菌体复合物重悬，37℃，220r/min，培养4-8h。

(2)菌体收集及样品前处理：加入0.5ml Buffer 1(D)与(1)处理后的菌液混匀，超声破碎10min。随后，加入100μL的Buffer 2(E)迅速混匀，避光反应15min。8000g离心取上清100μL，加入4μL胰蛋白酶(F)，在50℃的水浴锅中进行消化15min。加入0.5μL甲酸(G)终止胰蛋白酶消化，直接分析样品或在-20℃下储存直至分析。

(3)LC-ESI/QQQ的MRM模式靶向分析。

(4)定性判断方法：若金黄色葡萄球菌的9条特征肽阳性检出≥3条，则视为金黄色葡萄球菌阳性。若金黄色葡萄球菌肠毒素A的2条特征肽的阳性检出≥1条，则视为金黄色葡萄球菌肠毒素A阳性；若金黄色葡萄球菌肠毒素B的2条特征肽的阳性检出≥1条，则视为金黄色葡萄球菌肠毒素B阳性。