[发明专利]SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法及核酸适体

说明书

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2 RBD中和核酸适体的筛选方法及核酸适体，其包括如下序列中的至少一种：SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:15。本发明的核酸适体更容易与RBD蛋白结合并“击垮”RBD蛋白与受体ACE2之间的相互作用，其对SARS‑CoV‑2具有很强的中和效应以及高度的结合亲和力，能够有效地抑制病毒对细胞的侵染。由于本发明的核酸适体特有的生产周期短、生产成本低、免疫原性低等优点，使其在检测、预防和治疗新冠病毒方面很好地节约了时间成本，对于目前新冠病毒的防治具有重要意义，并且在临床上亦有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体及筛选方法。

背景技术

冠状病毒属的病毒是具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，在自然界中广泛存在。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2或2019 nCoV)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。SARS-CoV-2的蔓延趋势正以一种前所未有的方式改变着世界。使世界人民的经济生活、社会生活和精神生活都受到了巨大冲击。自疫情发生以来，全球已有超过2300万人感染了新冠病毒，并导致81.6万余人死亡。但疫情的发展不会就此而止步，在未来的一段时间内，病毒还会继续缓慢传播，并且世界也会处于大流行状态，对世界公共卫生有着巨大威胁，迫切需要新的预防和治疗策略

在病毒治疗方面，主要使用一些抗病毒药物，根据患者肺部严重程度，有时也使用抗炎症药物进行辅助治疗。目前尚无特异性药品用于新冠病毒的治疗。新冠肺炎疫情中使用的血浆疗法，通过提取新冠肺炎康复者血浆，并给患者人为地补给抗体。此种方法虽然能够取得一定的成效，但由于每个病人的免疫反应不同，血浆中含有的中和抗体的浓度和强度也不同，且受限于新冠肺炎患者数量庞大，康复者的血浆有限，因此并不适用于大范围内推广使用。抗体疗法除血清疗法外，单克隆抗体和基因工程抗体也被应用于一些疾病的治疗中。后两者虽可以实现大规模批量生产，但技术复杂、研制的实验周期较长、成本昂贵、且需要人源化过程，不同人群的诊疗结果大相径庭。因此，难以将其应用到疫情防控的前期主战场。

为了节约时间成本，研发具有生产周期短的核酸适体新型抑制剂十分必要。核酸适体是一种经体外筛选技术得到的结构化的寡核苷酸系列，与靶标分子有严格的识别能力和高度的结合亲和力。其具有分子量小、特异性强、免疫原性低，生产成本低等优点。但至今未见制备可用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎治疗的中和适体的报道。因此，研发核酸适体抑制剂，对SARS-CoV-2的研究和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法，包括如下步骤：

1)化学合成一个60-120个碱基的DNA初始文库；取初始文库溶于结合缓冲液中，进行变性处理；

2)将至少两种源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白作为适体筛选的交叉靶标；

3)将预处理的DNA文库与第一种源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白共孵育；产物进行PCR扩增；PCR产物用于筛选；

4)先通过SELEX方法以保证第一种源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA链的多个拷贝结合；

5)从步骤4)筛选之后，使用至少第二种源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA孵育，以获得与至少两种源表达的RBD都能结合的序列；

6)引入ACE2竞争；之后收集与ACE2竞争的序列。

在本发明中，交叉靶标来源可以为多种，包括但不限于人源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白以及通过昆虫表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白。

在本发明的优选实施例中，步骤4)，在SELEX方法筛选过程中，采用反筛靶标，反筛压力逐轮增加。