[发明专利]一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明通过优化编码猪细小病毒VP2蛋白和乙型脑炎E蛋白的核苷酸序列，配以信号肽GP64后使用昆虫‑杆状病毒真核表达系统进行表达，得到猪细小病毒VP2蛋白和乙型脑炎E蛋白结构与功能和天然状态完全一致，且显著提高了表达量，最大程度地保留了其免疫原性，配以佐剂制备成二联亚单位疫苗后可以同时对猪细小病毒与乙型脑炎起到较好的免疫保护作用，保护效果超过现有的猪细小病毒灭活疫苗与乙型脑炎病毒弱毒疫苗。和单价疫苗相比，具有简便、经济、实用和减少应激的优势。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)为细小病毒科细小病毒属成员，是一种小的无包膜病毒，具有单链DNA基因组结构，病毒粒子直径约20nm，基因组约5.2Kb。PPV有两个开放阅读框(ORF)，包括非结构蛋白(NS1)和主要结构蛋白(VP2)，VP2蛋白是诱导产生中和抗体的主要靶点，该病毒是引起猪繁殖障碍的主要疫病。该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。本病毒对外界理化因素有很强的抵抗力，对脂溶剂(如乙醚、氯仿等)有抵抗力；对酸、甲醛蒸汽和紫外线均有一定抵抗力；但是在0.5％漂白粉或氢氧化钠溶液中5min即可被杀死。

乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，呈球状，核酸为单链RNA，基因组全长11kb，外层有包膜，包膜表面有血凝素，直径40nm，内有衣壳蛋白(C)与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白(E)刺突，即病毒血凝素，E蛋白包裹在病毒的表面，决定着病毒的毒力和宿主范围，可刺激产生中和抗体，囊膜内尚有内膜蛋白(M)，参与病毒的装配。妊娠母猪感染后发生流产和产死胎，公猪发生睾丸炎，还可引起肥育猪持续高热和新生仔猪脑炎，乙脑病毒对热抵抗力弱，乙醚、1:1000去氧胆酸钠以及常用消毒剂均可灭活病毒。在酸性条件下不稳定，适宜pH8.5～9.0。

这两种病毒都是引起母猪繁殖障碍的重要传染病，流行于猪群当中，主要引起母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，给猪场造成极大的经理损失，严重制约养猪业发展。目前现有技术防控此类传染病主要依靠疫苗接种，但近年来，猪多种病原体混合感染的现象越来越普遍，使得病情越来越复杂，不但给临床诊断和防控带来了极大困难，也给猪场带来了巨大的经济损失。目前，对于这两种疾病的防治主要是分别免疫PPV灭活疫苗和JEV弱毒单苗，在规模化猪场，增加了免疫次数，增加了对猪体刺激，使猪体产生应激反应；此外乙型脑炎病毒疫苗为活疫苗，频繁多次使用增强了疫苗毒力返强的可能性。

发明内容

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供免疫原性组合物，包括：猪细小病毒VP2蛋白和乙型脑炎E蛋白；

所述猪细小病毒VP2蛋白和乙型脑炎E蛋白为利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列在昆虫-杆状病毒真核表达系统表达得到。

本方案使用杆状病毒表达系统对PPV VP2和JEV E蛋白进行表达，为猪细小病毒VP2与乙型脑炎病毒E蛋白二联基因工程疫苗的制备提供技术基础。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在体外使用Tn7转座子作用使外源基因插入到杆状病毒的基因组上，操作方便，快速有效，是目前使用最广泛的表达系统。同时昆虫细胞大规模悬浮培养技术成熟与应用，使得杆状病毒表达系统的应用更加广泛。杆状病毒载体表达系统使用P10启动子或PH启动子，将外源目的基因以单拷贝或者多拷贝形式插入到启动子下游，通过酶切酶连的方法获得重组杆状病毒，这种重组杆状病毒在昆虫细胞或虫体内感染的同时，使外源基因得到高效表达。