[发明专利]一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法

说明书

本发明公开了一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：(1)构建表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖水解酶的重组工程菌，诱导表达获得纤维二糖水解酶；(2)以纤维二糖水解酶为催化剂，以淫羊藿苷为底物进行转化反应，反应结束后将反应液分离纯化，制得淫羊藿次苷Ⅱ。本发明提供的生物法制备淫羊藿次苷Ⅱ，具有成本低、操作步骤简单、反应条件温和等特点，转化率达到98％以上，为淫羊藿次苷Ⅱ的大规模工业生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于酶催化的淫羊藿次苷Ⅱ的制备方法。

背景技术

淫羊藿为小檗科淫羊藿属草本植物，其作为药用植物已有2000多年的历史，其主要有效成分为黄酮类化合物淫羊藿苷。刘铁汉等人发现淫羊藿苷可被肠内菌代谢，主要代谢产物为淫羊藿的苷元，大鼠灌服淫羊藿苷后，吸收入血的主要代谢物为淫羊藿次苷Ⅱ(刘铁汉，王毅，王本祥等，淫羊藿苷的肠菌代谢研究I.肠内细菌对淫羊藿苷的代谢转化.中草药，2000,31(11)：834)，因此淫羊藿次苷Ⅱ可能是淫羊藿苷发挥生理活性的主要代谢产物。

近年来对于淫羊藿次苷Ⅱ的药理研究集中在心血管、肿瘤、中枢神经系统、免疫系统、生殖系统、骨组织等领域。在抗肿瘤方面，淫羊藿次苷Ⅱ对人鼻咽癌KB细胞、人慢性髓系白血病细胞K562、人早幼粒白血病细胞HL-60细胞均有显著的抑制作用。淫羊藿次苷Ⅱ能够通过增加线粒体和溶酶体膜的通透性诱导HepG2细胞的凋亡。此外，淫羊藿次苷Ⅱ能够使人黑色素瘤细胞A375阻滞在G0/G1期和G2/M期，并抑制cyclin E等周期相关蛋白表达。在中枢神经系统方面，淫羊藿次苷Ⅱ可以减轻APP/PS1转基因小鼠的空间学习和记忆障碍。这种保护作用似乎是由于ADAM10表达增加和APP、BACE1的表达减少，从而抑制了海马体和皮层的Aβ生成。这提示淫羊藿次苷Ⅱ可能是一种潜在的AD治疗药物。淫羊藿次苷Ⅱ对骨组织的作用则是国内研究的一个热点，淫羊藿次苷Ⅱ能够通过上调成骨细胞相关因子表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化发挥抗骨质疏松的作用。目前研究显示淫羊藿次苷Ⅱ是PDE5的特异性抑制剂，可显著提高阴茎海绵体内cGMP浓度，从而调节阴茎勃起，而且不影响大鼠阴茎海绵体平均动脉血压，有望成为抗ED的新型药物。因此，淫羊藿次苷Ⅱ在药品和保健品领域都有着广泛地应用，市场前景十分广阔。

尽管淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ在结构上只有一个糖基的差别，其结构式如图1所示，但许多证据表明，淫羊藿次苷Ⅱ比淫羊藿苷具有更显著的生理活性，如在抗ED领域。但是，天然的淫羊藿次苷Ⅱ在淫羊藿中含量极少，因此采用天然产物提取的方法直接从淫羊藿中提取淫羊藿次苷Ⅱ不具备可行性，经济效益较差。目前，已有研究机构展开化学法合成淫羊藿次苷Ⅱ的研究，但离产业化尚有距离。如何低成本、高效、环保地制备淫羊藿次苷Ⅱ成为当前的重要任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、反应条件温和、高效地制备淫羊藿次苷的方法，为淫羊藿次苷Ⅱ的大规模工业生产提供可行方案。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于酶催化的淫羊藿次苷Ⅱ的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖水解酶的重组工程菌，诱导表达获得纤维二糖水解酶；

(2)以纤维二糖水解酶为催化剂，以淫羊藿苷为底物进行转化反应，反应结束后将反应液分离纯化，制得淫羊藿次苷Ⅱ。

本发明利用纤维二糖水解酶(cbhB)对淫羊藿苷进行酶解，生物法制备淫羊藿次苷Ⅱ。所述纤维二糖水解酶基因源自斐济曲霉(Aspergillus fijiensis)，研究表明，该酶具有优异的催化活性，具体地，所述纤维二糖水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。