[发明专利]一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物、探针及检测方法，涉及基因检测技术领域。本发明提供一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物和探针，所述引物和探针为：正向引物F：5’‑ATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTAC‑3’；反向引物及探针P：5’‑GAATCAGGGTAACAGGAGCATTCCTCATAG[FAM‑dT]A[THF][BHQ1‑dT]AATTAGGGGCTTTCA[C3‑spacer]‑3’。本发明中基于RT‑RAA法的耐药突变检测技术具有快速、简单，对仪器要求低等优点，可以在临床上用于病毒耐药突变的POCT检测。对于甲型H1N1流感患者特别是重症病例和免疫抑制病例的耐药突变鉴定、及时改变用药策略具有很高的应用价值。通过临床样本测试，本方法与二代测序方法的检测结论完全一致，在检测速度、精准度和临床POCT可行性等综合能力上要优于荧光RT‑PCR、Sanger一代测序和二代测序等方法。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物、探针及检测方法。

背景技术

奥司他韦作为抗流感特效药，可以胶囊或颗粒口服，即可以预防又可以治疗，在临床上已经作为首选药被越来越多地应用，甚至亦可作为流感大流行期的抗病毒药物储备。但是随着奥司他韦的广泛使用，病毒病原体耐药性的问题随之而来。如何适度地应用奥司他韦，既能满足临床治疗的给药需求，又不会因为药物滥用引发耐药株传播而造成无药可用的尴尬境地，则需要精准及时的耐药监测数据支持。

目前针对流感病毒的神经氨酸酶抑制剂(NAI)耐药性检测主要包括两种：表型(Phenotype)检测和基因型(Genotype)检测。表型检测主要通过基于荧光底物MUNANA的神经氨酸酶活性和动力学参数来测量，检测前需要获取病毒纯培养物，费时费力。基因型检测方法目前主流的是基因Sanger测序和荧光定量PCR，可直接对原始样本进行检测，避免了病毒分离和增殖等费时费力的操作，且荧光定量PCR还可实现3-4小时检测耐药性突变，相比较测序和表型检测方法要简单迅速许多。但是荧光定量PCR对仪器的要求较高，需要调试校准，适合于微生物实验室操作，尚不能满足于临床应用。除了以上技术，二代测序方法还可以准确检测病毒群体中敏感/耐药毒株的比例。在甲型H1N1流感和H7N9禽流感感染患者中，均出现过敏感和耐药毒株共存的情况。而通过二代测序，含量低于总病毒数目1％的耐药毒株即可检测到。这种同时含有敏感/耐药的混合病毒在表型检测时往往表现出敏感的性状，掩盖了耐药毒株出现的事实，因此真实的耐药率有可能被严重低估。二代测序方法可以很好的解释表型检测结果所带来的困惑。但二代测序对临床样本的质量要求高、测序成本贵、测序周期长，使得其在临床的应用还很有限。

综上所述，亟需建立一套针对甲型H1N1流感病毒奥司他韦耐药突变的快速检测方法，进一步探索便捷的即时检测(POCT)临床应用，可以为流感病毒感染患者特别是重症和免疫抑制患者药物应用的精准医疗提供技术支撑。

发明内容

解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物、探针及检测方法，解决背景技术所提出的至少一个问题。

技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

第一方面：提供一种用于检测奥司他韦耐药突变的引物和探针，所述引物和探针为：

正向引物F：

5’-ATGTGCATGTGTAAATGGTTCTTGCTTTAC-3’；

反向引物及探针P：

5’-GAATCAGGGTAACAGGAGCATTCCTCATAG[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]AATTAGGGGCTTTCA[C3-spacer]-3’。