[发明专利]一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法

权利要求书

1.一种预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1、分子的筛选：

a、初步筛选出评估机体T细胞功能的免疫学指标；

b、收集HBsAg阳性和清除CHB患者以及健康对照的血样；

步骤2、检测方法：

a、收集患者的血样，进行细胞重悬种植；

b、配置抗体；

c、进行流式细胞术的检测，并保存数据，利用软件Flow Jo software V10.0.7进行数据分析；

步骤3、CD4和CD8 T细胞的HLA-DR预测效能的评估：利用ROC曲线，评估CD4和CD8 T细胞上HLA-DR表达水平在54例CHB患者48周内，进行HBsAg阴转的预测效能；

步骤4、发现可预测CHB患者48周内HBsAg阴转的T细胞免疫学指标HLA-DR。

2.如权利要求1所述的预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，其特征在于：

所述步骤1的a过程中，免疫学指标包括代表细胞活化(CD69、HLA-DR、CD95、CD25、CD40L)、耗竭(PD-1、TIM-3、CTLA-4)以及效应功能(Granzyme B、CD107a)。

3.如权利要求1所述的预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，其特征在于：

所述步骤2的a过程中的细胞重悬种植，包括以下步骤：

I、取新鲜的抗凝血和血样进行颠倒混悬，得到抗凝血血样；

II、将上述步骤Ⅰ中得到的抗凝血血样，缓慢倒入淋巴分离管中进行分离，得到乳白色单个核细胞层；

III、将上述Ⅱ步骤中得到的乳白色单个核细胞层，用吸管吸取至离心管中，并加入3～5ml的红细胞裂解液混匀进行离心，去上清，加入适量的胎牛血清，用枪头吹打重悬混匀，去上清，并加入3～5ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞备用；

IV、吸取10ul台盼蓝与10ul细胞悬液混匀显微镜下计数，洗涤细胞重悬后种植1*10⁵～1*10⁶个细胞于96孔U底板中。

4.如权利要求1所述的预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，其特征在于：

所述步骤2的b过程中配置抗体，包括以下步骤：

Ⅴ、将抗体1.5ulCD4、1.5ulCD8、1.5ulCD3、2ulHLA-DR以及0.5ulFVD抗体及43ul鞘液混匀；

Ⅵ、将上述Ⅳ步骤中种植细胞的96孔U底板离心1500rpm，5min，甩掉上清后将配置好的抗体混合液50ul加入相应的细胞中，轻微刮底重悬后置于4°冰箱孵育30分钟；

Ⅶ、孵育30分钟后取出96孔U底板，加入150ul的鞘液洗涤，离心1500rpm，5min后，甩掉上清，加入100ul的鞘液，重悬转移至加有100ul鞘液的流式管中进行流式细胞术的检测。

5.如权利要求1所述的预测CHB患者中HBsAg清除的免疫学指标的检测方法，其特征在于：

根据上述步骤3的结果显示CD4或者CD8 T细胞上HLA-DR的表达对于HBsAg 48周内的HBsAg阴转具有预测效能。