[发明专利]一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用

权利要求书

1.一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：

步骤一：锥形聚合物纳米通道的制备；将厚度为8-20微米的含有单个离子轰击径迹的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜暴露在波长为365nm的紫外光下照射一整夜，使原存于PET膜上的细小径迹更加充分，将照射后的PET膜贴在两个聚四氟乙烯的半电解池上，使电解池形成两个相互隔离的腔体，在一侧腔体中加入9M的NaOH作为蚀刻液，另一侧加入1M的HCOOH和1M的KCl作为蚀刻阻止液，并在两侧溶液中分别插入Pt电极，在两电极间施加1V的电压进行不对称蚀刻，蚀刻过程通过皮安计监测跨膜电流来控制，当跨膜电流达到0.1nA时，停止蚀刻程序，将刻蚀液替换成刻蚀阻止液，中和刻蚀液以阻止进一步刻蚀，随后，将稀释的1M的NaOH加入到两个电解池内，并施加相同的1V的跨膜电压，当电流值达到2nA时，停止刻蚀，将PET膜取出，洗涤后备用；

步骤二：ATP的检测：将制备好的PET聚合物锥形纳米通道膜紧密地贴在两个半电解池上，将聚合物锥形纳米通道的小口端一侧作为顺式腔，大口端一侧作为反式腔，向两侧腔体中均加入1M KCl的溶液作为支持电解质，然后将两支自制的Ag/AgCl电极分别对称地插入两侧腔体中，将一系列不同浓度ATP的溶液与捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)溶液反应，然后将反应混合溶液加入大口端一侧的KCl溶液中，施加-1.0V的电压，使含ATP的dsDNA迁移通过聚合物锥形纳米通道，采用膜片钳放大器测量并同步采集通过锥形纳米通道的电流信号数据，并使用滤波器，以获得单分子检测的脉冲信号；

步骤三：数据处理：利用Clampfit和origin软件对电流信号数据中的事件脉冲频率、事件脉冲振幅、滞留时间及事件间隔进行处理分析，以获得频率-浓度线性范围图、平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔，确定待测样品中ATP的含量。

2.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述蚀刻液一侧的Pt电极与电源正极相连，所述蚀刻阻止液一侧的Pt电极与电源负极相连。

3.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤二中1M的KCl溶液中包含10mM的Tris-HCl，且所述1M的KCl溶液的pH值为7.0。

4.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述捕获探针DNA(H1，H2)具有与待检测的ATP分子生物学相匹配的DNA序列，使得H1，H2能够将ATP捕获，同时辅助探针DNA(H3，H4)能够在ATP捕获后，被捕获探针新暴露出来的序列引发杂交链式反应，形成含有目标物ATP的长链的dsDNA，使ATP更易于被检测。

5.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述膜片钳放大器的采样频率为20kHz，所述滤波器频率为5kHz。

6.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述待测样品中ATP的含量由事件频率数对照频率-浓度线性范围图来确定，ATP的构象信息和动力学行为可通过平均电流脉冲振幅、平均滞留时间和平均事件间隔进行分析。

7.如权利要求1所述的一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，其特征在于，所述ATP检测方法的应用包括ATP相关疾病的临床诊断、ATP辅酶类药物分析、肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析。