[发明专利]一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用

说明书

本发明提供一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：锥形聚合物纳米通道的制备；ATP的检测；数据处理。本发明在检测生物细胞ATP分子时，具有操作简单、耗时较少、成本较低的特点，通过设计捕获探针DNA(H1，H2)和辅助探针DNA(H3，H4)的DNA序列，实现ATP分子的特异性检测，同时具有良好的抗干扰能力，且在检测生物细胞ATP分子时无需分子标记，可实现高通量、超灵敏检测，检出限可低至pM级别，同时还可观测到单分子指纹信息。

技术领域

本发明属于生物细胞分子检测、诊断技术领域，尤其涉及一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是细胞内能量来源的主要提供者，它参与细胞内的新陈代谢过程，在维持生物体正常机能方面起着重要作用。近年来，已有多种疾病被证实与ATP的含量异常有关，如心血管疾病、帕金森症和阿尔茨海默氏症。又由于细胞的增值、分化和死亡等过程均会引起ATP含量的改变，因此通过监测ATP含量的变化可用来评价药物敏感性与细胞免疫活性，进而推动细胞生理病理、癌症调控机理等方面的研究。此外，ATP也是用于治疗肌肉萎缩、脑溢血后遗症、心肌疾病、肝炎等疾病的辅酶类药物。目前，ATP的检测方法已被应用于肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、细胞活性和微生物含量分析等领域，但对于生物体复杂细胞环境中ATP含量的实时监测仍然存在挑战。因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的ATP检测方法对于临床医学诊断具有重要的指导意义。

传统的ATP的检测方法主要有电泳法、高效液相色谱法、同位素示踪法、生物发光法和化学发光法等；电泳法测定ATP，样品需先经电泳分离，然后再采用紫外光谱法进行比色分析，操作复杂；高效液相色谱法也需要复杂的分离过程，且仪器与试剂价格昂贵。同位素示踪法具有简单、灵敏等优点，但放射性同位素不利于研究者的身体健康，限制了其应用；化学发光法和生物发光法虽然具有较高的测量精度，但其方法的稳定性和特异性仍是急需待解决的难题。于是开发一种性能稳定、高灵敏度的ATP检测方法势在必行。

近年来，核酸适配体作为新兴的分子识别探针，以其高亲和力、高特异性、高稳定性与设计灵活等优点受到了研究者的青睐。于是基于荧光法、比色法和电化学法的ATP核酸探针传感方法相继出现，核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段，可以与目标物质高特异性、高选择性地结合。然而，单链核酸适配体序列较长，自身的构型也会发生变化，导致假阳性信号的产生，限制了其在实际样品中的应用。随后，研究者通过对核酸适配体进行裂分，获得了裂开型核酸适配体，弥补了单链核酸适配体探针的缺点。裂开型核酸探针是由两条单链寡核苷酸组成，目标分子的存在可以促使两条核酸探针相结合，使裂开型适配体彼此靠近，产生阳性信号。但上述方法大多是基于检测目标分子总体事件的平均值，背景干扰较大，并且ATP在细胞外分布较少、浓度低、流失迅速，难以检测。

因此，急需建立一种快速、超灵敏的ATP检测方法，能够快速、简便、灵敏、可靠的用于细胞内ATP的检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速、超灵敏的ATP检测方法及其应用，所述ATP检测方法包括三个基本步骤，分别为：

步骤一：锥形聚合物纳米通道的制备；将厚度为8-20微米的含有单个离子轰击径迹的PET膜暴露在波长为365nm的紫外光下照射一整夜，使原存于PET膜上的细小径迹更加充分，将照射后的PET膜贴在两个聚四氟乙烯的半电解池上，使电解池形成两个相互隔离的腔体，在一侧腔体中加入9M的NaOH作为蚀刻液，另一侧加入1M的HCOOH和1M的KCl作为蚀刻阻止液，并在两侧溶液中分别插入Pt电极，在两电极间施加1V的电压进行不对称蚀刻，蚀刻过程通过皮安计监测跨膜电流来控制，当跨膜电流达到0.1nA时，停止蚀刻程序，将刻蚀液替换成刻蚀阻止液，中和刻蚀液以阻止进一步刻蚀，随后，将稀释的1M的NaOH加入到两个电解池内，并施加相同的1V的跨膜电压，当电流值达到2nA时，停止刻蚀，将PET膜取出，洗涤后备用；