[发明专利]一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物及扩增测序方法在审
| 申请号： | 202011000351.4 | 申请日： | 2020-09-22 |
| 公开（公告）号： | CN112080589A | 公开（公告）日： | 2020-12-15 |
| 发明（设计）人： | 孟哲峰;杜玲 | 申请（专利权）人： | 上海市闵行区中心医院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6869;C12N15/11 |
| 代理公司： | 天津市尚仪知识产权代理事务所(普通合伙) 12217 | 代理人： | 王山 |
| 地址： | 201199 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 血浆 直接 扩增 艾滋病 病毒 基因组 核酸 组合 方法 | ||
1.一种用于从血浆中直接扩增艾滋病病毒基因组的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物序列：
gag-pol外套上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；
gag-pol外套下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
gag-pol内套上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；
gag-pol内套下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
pol-env外套上游引物序列如SEQ ID NO.5所示；
pol-env外套下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
pol-env内套上游引物序列如SEQ ID NO.7所示；
pol-env内套下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；
env-nef外套上游引物序列如SEQ ID NO.9所示；
env-nef外套下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；
env-nef内套上游引物序列如SEQ ID NO.11所示；
env-nef内套下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。
2.一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.样本处理：分离样本血浆，检测样本的病毒拷贝数，选取5000-120000拷贝/ml的样本；
b.RNA抽提：对血浆中的HIV-1 RNA进行抽提；
c.反转录：将抽提的HIV-1 RNA反转录成cDNA；
d.PCR扩增：采用三段式扩增，使用权利要求1中的引物，从合成的cDNA中扩增HIV-1基因组；
e.测序。
3.根据权利要求2所述的一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：步骤d中，PCR扩增分两轮进行，第一轮PCR反应体系如下：
4.根据权利要求3所述的一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：第一轮PCR反应条件为：94℃2min热变性，1个循环；96℃10s，68℃1min/kb，15个循环；95℃10s，68℃1min/kb+5s/循环，15个循环；68℃15min。
5.根据权利要求3所述的一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：第二轮PCR反应体系如下：
6.根据权利要求3所述的一种从血浆中直接扩增测序艾滋病病毒基因组的方法，其特征在于：第二轮PCR反应条件为：94℃2min热变性，1个循环；96℃10s，68℃1min/kb，15个循环；95℃10s，68℃1min/kb+5s/循环，15个循环；68℃20min。
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