[发明专利]一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法

权利要求书

1.一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），配制筛选培养液，所述的筛选培养液为1/2MS基本培养基+15g/L蔗糖+100~400mg/L卡那霉素；

步骤（2），对基因编辑烟草种子消毒；

步骤（3），在培养皿底部铺无菌滤纸，将步骤（2）中消毒完成的种子转移到滤纸上铺开，加入步骤（1）中的筛选培养液进行培养，培养期间及时补充培养液，保持滤纸为湿润状态；

步骤（4），当观察到种子萌发长出子叶时，若整棵小苗呈黄色或白色，则种子为无标签；若呈绿色，则种子携带卡那霉素抗性标签。

2.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的筛选培养液为1/2MS基本培养基+15g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素。

3.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，步骤（1）中，配制筛选培养液的具体步骤为：在1/2MS基本培养基中添加蔗糖至浓度为15g/L，pH值为5.5-5.9，高温高压灭菌，冷却后再添加经过过滤灭菌后的卡那霉素至浓度为100~400mg/L，4℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，在1/2MS基本培养基中添加蔗糖至浓度为15g/L，pH值为5.7；高温高压灭菌的温度为121℃，压力为103.4kPa，时间为15-20min。

5.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，步骤（2）中，种子消毒的具体方法为：取基因编辑烟草种子于超净工作台上，用体积浓度为75％的酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗后再用质量浓度为1%的AgNO₃溶液消毒7-10min，无菌水浸泡清洗后用无菌滤纸吸干种子表面水分。

6.根据权利要求5所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，无菌水冲洗次数为至少2次；无菌水浸泡清洗次数为至少5次。

7.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，步骤（3）中，在培养皿底部铺一张无菌滤纸，将步骤（2）中消毒完成的种子转移到滤纸上铺开，加入步骤（1）中的筛选培养液至将滤纸浸湿并没过种子高度的一半。

8.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，步骤（3）中，种子筛选培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d，培养14-21d。

9.根据权利要求1所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，收集步骤（4）种子萌发出的小苗，提取DNA，针对特异性基因序列设计引物或采用国家标准通用引物进行PCR及凝胶电泳检测标签条带，以确认步骤（4）结果准确性。

10.根据权利要求9所述的利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，其特征在于，DNA提取使用植物基因组DNA提取试剂盒，根据说明书操作提取；PCR检测方法使用国家标准《烟草及烟草制品转基因检测方法GBT 24310-2009》：35S启动子序列扩增，扩增引物对为35S-1和35S-2，该引物对扩增片段长度205bp；nos终止子序列扩增，扩增引物对为NOS-1和NOS-2，该引物对扩增片段长度213bp；1.5%琼脂糖凝胶电泳，145V，45min，检测标签条带；

其中，35S-1：5’-ctacaaatgccatcattgcg-3’；

35S-2：5’-gggtcttgcgaaggatagtg-3’；

NOS-1：5’-gattgaatcctgyygccggt-3’；

NOS-2：5’-gtaacatagatgacaccgcg-3’。