[发明专利]一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法

说明书

本发明涉及一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，属于植物细胞工程技术领域。该方法包括筛选培养液的配制、基因编辑烟草种子消毒、种子筛选培养、是否携带卡那霉素抗性标签的判定这几大步骤。通过本发明方法可便捷有效地筛选出基因编辑素材中无转基因标签的素材。本发明同时利用PCR扩增载体片段的方法验证了卡那霉素浸泡种子筛选结果的可靠性，为基因编辑烟草育种过程中繁重的筛选工作提供了经济、便捷、可靠的筛选无标签基因编辑烟草素材的方法，可降低筛选成本、提高生产效率。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法。

背景技术

基因编辑技术不仅是解析阐明基因功能的重要工具，在植物育种上更为划时代的重大突破。CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein，串联间隔短回文重复序列）是近几年来新发现的一种基因定点编辑技术，CRISPR/Cas9是目前应用最多的，只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA:tracrRNA（CRISPR-derived RNA: trans-activating RNA）复合体就可对特定外源DNA序列进行剪切，基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术具有高效方便等特点。该技术已在拟南芥、烟草、水稻等多种植物中成功编辑，证明了该技术的可行性，并实现了植物抗逆境、延缓果实成熟、增加杀草剂耐受性、抗病等效果。

为了便于基因编辑材料的前期筛选，目前用于植物基因编辑载体的构建中都整合了卡那霉素抗性基因，如图1所示。利用农杆菌转化叶盘，通常会在培养基中加入一定浓度的卡那霉素，能有效地获得在选择培养基中分化的转化苗，又可减轻后期检测和鉴定的工作量。在烟草基因编辑育种过程中，需要在组织培养获得的T0代分化苗中筛选出具有卡那霉素抗性的植株，以确保基因编辑载体进入到植株体内；然后经过每一代不断的自交纯合，T1代及以后需要筛选出的目的植株为基因靶点编辑成功、脱载体标签的纯合植株；自交纯合后的素材筛选工作量成倍增长，分子检测费用高昂。因此如何克服现有技术的不足，提供一种快速方便、可视化强、经济实惠的方法来筛选基因编辑无标签素材是目前植物细胞工程技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用卡那霉素快速筛选无标签基因编辑烟草素材种子的方法，包括如下步骤：

步骤（1），配制筛选培养液，所述的筛选培养液为1/2MS基本培养基+15g/L蔗糖+100~400mg/L卡那霉素；

步骤（2），对基因编辑烟草种子消毒；

步骤（3），在培养皿底部铺无菌滤纸，将步骤（2）中消毒完成的种子转移到滤纸上铺开，加入步骤（1）中的筛选培养液进行培养，培养期间及时补充培养液，保持滤纸为湿润状态；

步骤（4），当观察到种子萌发长出子叶时，若整棵小苗呈黄色或白色，则种子为无标签；若呈绿色，则种子携带卡那霉素抗性标签。

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的筛选培养液为1/2MS基本培养基+15g/L蔗糖+200mg/L卡那霉素；

进一步，优选的是，步骤（1）中，配制筛选培养液的具体步骤为：在1/2MS基本培养基中添加蔗糖至浓度为15g/L，pH值为5.5-5.9，高温高压灭菌，冷却后再添加经过过滤灭菌后的卡那霉素至浓度为100~400mg/L，4℃保存备用。

进一步，优选的是，在1/2MS基本培养基中添加蔗糖至浓度为15g/L，pH值为5.7；高温高压灭菌的温度为121℃，压力为103.4kPa，时间为15-20min。