[发明专利]高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。本发明还提供发酵生产核苷的方法，包括：(1)增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA；和/或增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA；(2)将步骤(1)获得的基因增强菌株用于核苷的发酵生产。本发明提供的枯草芽孢杆菌工程菌为核苷高产菌株，能有效积累核苷，提高核苷的产量，为核苷的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及微生物领域和生物工程技术领域，具体地说，涉及高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160-240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。

腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。

鸟苷，化学名称：9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤。它可作为食品或医药原料的中间体，用于生产5’-鸟苷酸二钠、鸟嘌呤、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦等食品添加剂或医药原料。

肌苷，化学名称：9-β-D-核糖次黄嘌呤。是细胞代谢改善药，参与体内核酸代谢，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶A与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。适用于各种慢性肝脏疾患、心脏疾患、白血球或血小板减少症、中心性视网膜炎等，并可预防接触锑剂引起的对肝脏心脏的副作用。

嘌呤核苷既可通过化学法合成，也可通过微生物发酵法合成，并且微生物发酵法由于其诸多的优势(条件温和、环境污染小)，已成为主流生产方法。但发酵法的缺点是成本高、转化率低。因此，亟需通过代谢工程的手段，改善菌种性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产核苷的方法或提高核苷发酵产量的方法。

本发明的另一目的是提供高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。

本发明构思如下：核苷合成对氮同化的需求远高于氨基酸合成，腺嘌呤环涉及5个氮同化，其中2个来自谷胺酰胺。发明人在研发中意外地发现，通过增强核苷合成代谢过程中的氮供应可以明显地促进嘌呤核苷的合成，且强化氮供应的方式不止一种，组合强化可起到叠加的效果。

尽管gltB不是核苷合成的关键基因，却是谷氨酸合酶合成的关键基因，该酶催化谷氨酸合成；而glnA又是谷氨酰胺合成酶的关键基因，催化谷氨酸向谷氨酰胺合成。本发明通过gltB点突变、gltB和glnA强启动子替换达到gltB和glnA基因强化目的。

gltB强化条件下，促进谷氨酸合成，glnA强化条件下，促进谷氨酰胺合成，谷氨酰胺是核苷合成的直接前体，进一步满足核苷合成氮同化需求。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种发酵生产核苷的方法或提高核苷发酵产量的方法，包括以下步骤：