[发明专利]一种用于茄子育种的原生质体电融合方法

权利要求书

1.一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、酶解制备原生质体：

取1#茄子幼苗嫩叶和2#茄子幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片并分别置于CPW13M溶液中密封预处理30min，过滤去除CPW溶液，将组织片分别置于CPW9M溶液中清洗2～3次；

按一定茄子幼苗嫩叶与酶解液的质量体积比将所得预处理后的组织片分别放入酶解液中，分别封好封口膜后置于一定温度、转速下，于黑暗条件下进行酶解，分别得到两种亲本的酶解产物；

步骤二、分离纯化原生质体：

将步骤一所得两种亲本的酶解产物分别依次过筛，收集两种亲本的原生质体粗溶液，离心收集沉淀并用CPW盐质量浓度为9％的CPW水溶液重复洗涤离心1～2次，分别获得分离纯化后的1#茄子原生质体和2#茄子原生质体；

步骤三、原生质体钝化处理：

将步骤二所得1#茄子原生质体置于离心管中，用碘乙酰胺钝化其细胞质：用CPW10M溶液将步骤二得到的1#茄子原生质体沉淀调成原生质体密度为3×10⁵个/mL的悬液，向1#茄子原生质体悬液中加入碘乙酰胺处理液进行钝化处理，离心收集1#茄子原生质体，用CPW水溶液洗涤后备用；

将步骤二所得2#茄子原生质体置于培养皿中，用紫外线钝化其细胞核：用CPW10M溶液将步骤二所得2#茄子原生质体沉淀调成原生质体密度为1.5×10⁵个/mL的悬液，取原生质体悬液置于无盖培养皿中，以紫外线照射进行钝化处理；

步骤四、原生质体促融处理：

将步骤三所得经过钝化处理的1#茄子原生质体钝化处理液和2#茄子原生质体钝化处理液用EGTA进行促融处理：以氯化钠溶液为溶剂、以EGTA为溶质配制EGTA促融液，将1#茄子原生质体和2#茄子原生质体分别平铺于培养皿中，按一定的原生质体钝化处理液与EGTA促融液的体积比分别向培养皿中加入所述EGTA促融液进行促融处理，收集促融处理后的1#茄子原生质体混悬液和2#茄子原生质体混悬液，待用；

步骤五、原生质体的电融合处理：

将步骤四所得促融处理后的1#茄子原生质体混悬液和2#茄子原生质体混悬液等体积混合后放入电融合仪的融合小室中进行电融合，融合结束后吸取融合小室内的融合液并用一定摩尔浓度的甘露醇溶液定容至1mL，取其稀释液涂布于愈伤组织诱导培养基中培养，置于27℃恒温避光培养6～8周即可形成愈伤组织团块。

2.根据权利要求1所述一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，其特征在于，步骤一所述CPW13M溶液以质量体积比为13％的甘露醇溶液为溶剂，以CPW盐为溶质配制而成；所述CPW9M溶液以质量体积比为9％的甘露醇溶液为溶剂，以CPW盐为溶质配制而成；所述CPW盐的配方为KH₂PO₄27.2mg/L、KNO₃101.0mg/L、CaCl₂·2H₂O 1480.0mg/L、MgSO₄·7H₂O246.0mg/L、KI 0.16mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，pH 5.8。

3.根据权利要求1或2所述一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，其特征在于，步骤一所述酶解液以CPW盐的水溶液为溶剂，含有如下质量浓度的组分：1～2％纤维素酶、0.1～0.2％果胶酶、6～12％甘露醇；步骤一所述茄子幼苗嫩叶与酶解液的质量体积比为1g：15～30mL；所述酶解温度为35～45℃，所述转速为50～100r/min，所述酶解时间为3～6h。

4.根据权利要求3所述一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，其特征在于，所述纤维素酶的酶活为20000～30000U，所述果胶酶的酶活为10000～60000U。

5.根据权利要求4所述一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，其特征在于，步骤一所述酶解液中还含有6～8mmol/100mL的抗坏血酸。