[发明专利]一种用于茄子育种的原生质体电融合方法

说明书

本发明涉及一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，属于植物育种技术领域。为解决现有茄子育种方法周期长、效率低、预见性差的问题，本发明提供了一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，将茄子供体和受体组织分别酶解制备原生质体、分离纯化原生质体、对供体和受体原生质体分别进行钝化处理、促融处理以及电融合处理。本发明钝化后的供、受体经电融合后形成的杂种细胞由于生理代谢得到互补，可恢复分裂形成愈伤组织，且只有杂种细胞才能获得再生植株，该筛选体系简单省时，而且获得的杂种植株都是亲本基因，不存在不安全因素，易于推广使用。本发明能够显著提高茄子两个亲本的融合率，实现了茄子抗病性、抗逆性等优良品质特性的高效转移。

技术领域

本发明属于植物育种技术领域，尤其涉及一种用于茄子育种的原生质体电融合方法。

背景技术

茄子属果蔬类，营养丰富，含有较高的蛋白质、维生素及多种微量元素，是我国北方地区夏秋季主要蔬菜品种。但一些原有的本地品种混杂退化严重、产量低、品质差，很难适应大棚、覆膜等保护地栽培的需要及消费者对质量的要求，因此，寻求早熟、质优、高产、抗逆性强的茄子新品种是目前育种工作的当务之急。

目前育种使用的常规育种技术存在以下三方面的缺陷：一是育种周期长，从杂交到育出品种一般需要七八年甚至十多年；二是效率低，每年要配制几十甚至几百个杂交组合，而从中筛选出的优质品种却寥寥无几；三是预见性差，一般很难预测杂交后代的表现，不能有针对性的进行选育。

发明内容

为解决现有茄子育种方法周期长、效率低、预见性差的问题，本发明提供了一种用于茄子育种的原生质体电融合方法。

本发明的技术方案：

一种用于茄子育种的原生质体电融合方法，包括如下步骤：

步骤一、酶解制备原生质体：

取1#茄子幼苗嫩叶和2#茄子幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片并分别置于CPW13M溶液中密封预处理30min，过滤去除CPW溶液，将组织片分别置于CPW9M溶液中清洗2～3次；

按一定茄子幼苗嫩叶与酶解液的质量体积比将所得预处理后的组织片分别放入酶解液中，分别封好封口膜后置于一定温度、转速下，于黑暗条件下进行酶解，分别得到两种亲本的酶解产物；

步骤二、分离纯化原生质体：

将步骤一所得两种亲本的酶解产物分别依次过筛，收集两种亲本的原生质体粗溶液，离心收集沉淀并用CPW盐质量浓度为9％的CPW水溶液重复洗涤离心1～2次，分别获得分离纯化后的1#茄子原生质体和2#茄子原生质体；

步骤三、原生质体钝化处理：

将步骤二所得1#茄子原生质体置于离心管中，用碘乙酰胺钝化其细胞质：用CPW10M溶液将步骤二得到的1#茄子原生质体沉淀调成原生质体密度为3×10⁵个/mL的悬液，向1#茄子原生质体悬液中加入碘乙酰胺处理液进行钝化处理，离心收集1#茄子原生质体，用CPW水溶液洗涤后备用；

将步骤二所得2#茄子原生质体置于培养皿中，用紫外线钝化其细胞核：用CPW10M溶液将步骤二所得2#茄子原生质体沉淀调成原生质体密度为1.5×10⁵个/mL的悬液，取原生质体悬液置于无盖培养皿中，以紫外线照射进行钝化处理；

步骤四、原生质体促融处理：

将步骤三所得经过钝化处理的1#茄子原生质体钝化处理液和2#茄子原生质体钝化处理液用EGTA进行促融处理：以氯化钠溶液为溶剂、以EGTA为溶质配制EGTA促融液，将1#茄子原生质体和2#茄子原生质体分别平铺于培养皿中，按一定的原生质体钝化处理液与EGTA促融液的体积比分别向培养皿中加入所述EGTA促融液进行促融处理，收集促融处理后的1#茄子原生质体混悬液和2#茄子原生质体混悬液，待用；