[发明专利]用于鉴别柿树性别的引物及其应用在审
申请号: | 202011009770.4 | 申请日: | 2020-09-23 |
公开(公告)号: | CN112063705A | 公开(公告)日: | 2020-12-11 |
发明(设计)人: | 孙鹏;傅建敏;王丽媛;李华威;索玉静;韩卫娟;刁松锋;王艺儒 | 申请(专利权)人: | 国家林业和草原局泡桐研究开发中心 |
主分类号: | C12Q1/6879 | 分类号: | C12Q1/6879;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 北京冠榆知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11666 | 代理人: | 朱亚琦 |
地址: | 450003 *** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 鉴别 性别 引物 及其 应用 | ||
1.用于鉴别柿树性别的引物,其特征在于,包括MF正向引物和MF反向引物,其序列分别为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的用于鉴别柿树性别的引物用于鉴别柿树完全雄株和雌雄同株的应用。
3.根据权利要求2所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,采用PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳检测技术,利用鉴别柿树性别的引物对柿树完全雄株和雌雄同株的性别鉴别。
4.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(1)柿基因组DNA的提取;
(2)利用权利要求1所述的正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增,产物用1.0wt%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(3)对PCR产物进行克隆测序;
(4)根据测序结果对柿树进行性别鉴定。
5.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(1)中,使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取柿基因组DNA:
(1-1)称取0.5g的新鲜植物叶片,在液氮中充分研磨,转移到已灭菌的1.5ml离心管中;
(1-2)加700μL65℃预热的Buffer PCD和14μLβ-巯基乙醇到离心管中,充分混匀,65℃水浴20min,间或混摇2-3次;
(1-3)加等体积的氯仿到混合液中混匀,12000rpm离心5min;
(1-4)吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中,加与上清液等体积的Buffer BD,吸打混匀,再加入与上清液等体积的无水乙醇,吸打混匀;
(1-5)转移离心管中的混合液到吸附柱中,室温静置2min,10000rpm离心1min,倒掉收集管中的液体;
(1-6)吸取500μL混有异丙醇的PW Solution到吸附柱中,室温静置2min,10000rpm离心1min,倒掉收集管中的液体;
(1-7)将吸附柱放回收集管中,在离心机上以12000rpm的转速离心2min;
(1-8)取出吸附柱置于新的1.5mL离心管中,加50μL 60℃预热的TE Buffer洗脱,室温静置3min,12000rpm离心2min,丢弃吸附柱,离心管中的液体即为获得的柿基因组DNA;
(1-9)柿基因组DNA提取后,利用紫外分光光度计检测样品的浓度,利用1.0wt%的琼脂糖凝胶检测样品的质量,样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。
6.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(2)中,PCR扩增的程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸1min,重复循环30次;72℃延伸5min。
7.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(2)中,PCR扩增的体系为:Taq DNA聚合酶12.5μL;浓度为10μM的上游引物1μL;浓度为10μM的下游引物1μL;模板DNA 1μL;ddH2O 9.5μL。
8.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(2)中,PCR扩增产物用1.0wt%的琼脂糖凝胶电泳检测;电泳条件为150V、400mA,电泳时间为20min。
9.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(3)中:
(3-1)PCR扩增产物经电泳检测合格后,用PCR产物纯化回收试剂盒进行凝胶回收;
(3-2)将回收纯化的产物连接到pUC18-T载体,转化到大肠杆菌;
(3-3)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落,用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基,37℃培养过夜;
(3-4)筛选白色单克隆菌斑进行PCR鉴定,挑选阳性菌落进行测序。
10.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用,其特征在于,在步骤(4)中:完全雄株和雌雄同株的柿树有一条含有270bp的条带,其序列为序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列,雌株柿树未产生该条带。
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