[发明专利]用于鉴别柿树性别的引物及其应用

说明书

本发明公开用于鉴别柿树性别的引物，包括MF正向引物和MF反向引物，为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。用于鉴别柿树性别引物的应用：柿基因组DNA的提取；利用正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增；对PCR产物进行克隆测序；根据测序结果对柿树进行性别鉴定。本发明所提供的MF引物可用于预测柿种质资源的雌雄类型，在样品性别来源未知的情况下，可通过检测样品中是否存在特异核苷酸序列，鉴定出其是否开雄花，鉴定结果的准确率大于91％，为柿性别的鉴定提供了简便、快捷、有效的分子标记。

技术领域

本发明涉及分子鉴别技术领域。具体地说是用于鉴别柿树性别的引物及其应用。

背景技术

柿(Diospyros kaki Thunb.)属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，是原产我国的、重要的木本粮食树种，在食品、保健、化工和医药等领域的开发价值和应用潜力越来越受到重视。柿绝大部分栽培品种为完全雌株(只开雌花)，少数为雌雄同株(同时开雌花和雄花)。此外，在我国的江苏、湖南、湖北、江西、广西等地的野生山区，存在少量完全雄株(只开雄花)。

日本学者以雌雄同株和完全雌株柿树为研究材料，对其性别决定位点进行分析发现，雄花的产生必然需要OGI基因的参与，也就是说，利用OGI基因可以将完全雌株和雌雄同株柿树进行区分(Akagi et al.，2016)。值得注意的是，受实验材料的限制，该研究并未对我国特有柿种质资源-完全雄株进行性别鉴定。因此，很有必要开发新的分子标记以探索其在柿完全雄株中的表现，这对于不同类型柿种质资源性别的精准鉴定，具有重要应用价值。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于鉴别柿树性别的引物及其应用，利用本发明的分子标记可有效筛选开雄花的柿种质资源(包括完全雄株和雌雄同株)和不开雄花的柿种质资源(完全雌株)。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

用于鉴别柿树性别的引物，包括MF正向引物和MF反向引物，其序列分别为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。

上述用于鉴别柿树性别的引物用于鉴别柿树完全雄株和雌雄同株的应用。

上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，采用PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳检测技术，利用鉴别柿树性别的引物对柿树完全雄株和雌雄同株的性别鉴别。

上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，

包括如下步骤：

(1)柿基因组DNA的提取；

(2)利用权利要求1所述的正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增，产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)对PCR产物进行克隆测序；

(4)根据测序结果对柿树进行性别鉴定。

上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(1)中，使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取柿基因组DNA：

(1-1)称取0.5g的新鲜植物叶片，在液氮中充分研磨，转移到已灭菌的1.5ml离心管中；

(1-2)加700μL65℃预热的Buffer PCD和14μLβ-巯基乙醇到离心管中，充分混匀，65℃水浴20min，间或混摇2-3次；

(1-3)加等体积的氯仿到混合液中混匀，12000rpm离心5min；

(1-4)吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中，加与上清液等体积的Buffer BD，吸打混匀，再加入与上清液等体积的无水乙醇，吸打混匀；