[发明专利]提高单链DNA连接效率的方法

说明书

本发明提供了一种提高单链DNA连接效率的方法，在单链DNA的5’‑磷酸基末端和单链DNA的3’羟基末端设计二级结构，该二级结构通过末端核苷酸序列的互补配对的方式，将需要连接的单链DNA的5'‑PO₄与3'‑OH之间的距离拉近，从而提高长片段DNA的成环效率及两个片段的连接效率。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种提高DNA连接效率的方法,特别涉及到利用CircLigase连接单链DNA成环制备环状单链及利用CircLigase连接两个单链DNA片段。

背景技术

CircLigase是一种属于T4 RNA连接酶1家族中的具有热稳定性的连接酶，其作用底物单链核酸可以是单链DNA或者RNA，借助ATP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与3'-OH生成磷酸二酯键。它是分子生物学许多分支发展中的关键酶，因为它具有很好的分子内连接单链核酸的能力。但是，当DNA长度超过100个核苷酸(nt)时，其连接效率会随着目标DNA长度的增加而显著降低。这也在一定程度上限制了它的应用。另外利用CircLigase将任意两条链连接成为一条链的效率极低。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种提高DNA连接效率的方法。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种提高单链DNA连接效率的方法，在单链DNA的5’-磷酸基末端和单链DNA的3’羟基末端设计二级结构；

所述二级结构为：所述5’-磷酸基末端的核苷酸序列与所述3’羟基末端的核苷酸序列互补配对；或

所述二级结构由单链DNA的5’-磷酸基末端、单链DNA的3’羟基末端与接头DNA组成，所述接头DNA的核苷酸序列分别与所述5’-磷酸基末端的核苷酸序列、所述3’羟基末端的核苷酸序列互补配对。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过在单链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基末端和3’羟基末端设计二级结构，通过末端核苷酸序列的互补配对的方式，将需要连接的单链DNA的5'-PO4与3'-OH之间的距离拉近，从而提高长片段DNA的成环效率及两个片段的连接效率。

附图说明

图1为分子内连接成环设计示意图；

图2为分子内设计示意图及环化效率测试，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式测定不同设计及无二级结构的反应条件下的成环效率；

图3为分子内连接设计不同Linker及DNA底物环化反应结果对比图；

图4为分子内连接示意图及环化反应结果对比图；

图5为分子间连接设计示意图；

图6为分子间设计示意图及连接效率测试，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式测定不同设计及无二级结构的反应条件下的连接效率。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。