[发明专利]转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用

权利要求书

1.一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌，该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)L1-vdh，建议的分类命名为Bacillus ligniniphilus，保藏号为：CGMCC No.19226。

2.利用权利要求1所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

(1)木质素解聚混合物的制备：将工业木质素或者预处理后的含木质素预处理液采用热裂解方法、酶解聚方法、微波、金属催化剂裂解方法、碱水解方法等方法的一种处理，达到解聚木质素的目的，解聚反应液pH调至中性备用；

(2)将嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)的基因工程菌L1-vdh(保藏号：CGMCC No.19226)冻存管接种到含有卡那霉素(50μg.ml^-1)的2216E培养基中37℃活化预培养24h，然后按照1:10(V/V)的比例接入发酵培养基在发酵罐内37℃培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，培养过程中通过补料方式在葡萄糖低于5g/L的时候补充葡萄糖，在发酵OD值30以上时停止发酵，然后将发酵液置换为以木质素解聚产物为单碳源的MM63培养基，在37℃继续培养24h，通过NaOH和HCl调整pH在9左右，以HPLC检测香草醛合成量；

(3)发酵液通过离心或者陶瓷膜过滤收集上清液，置入储罐备用；收集的菌体通过高压均质机破碎细胞，然后通过陶瓷膜过滤收集上清液，然后与发酵液上清液合并置入储罐；

(4)上清液通过聚砜超滤膜除去杂蛋白、多肽、多糖等其它聚合物，收集滤液；

(5)滤液经有机溶剂萃取、浓缩、结晶等常规步骤制备香草醛。

3.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的热裂解方法：将不高于10％(v/v)的木质素水溶液在反应釜中以250-450℃的温度热裂解5-30分钟；压力控制在30兆帕以内。

4.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的酶解聚方法：将漆酶以0.1g/L的浓度溶解有乙酸盐缓冲液(pH 4)中，然后将漆酶溶液以1:1(v/v)比例与10％的木质素溶液混合均匀，在30℃下反应12小时。

5.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的碱水解方法：将不高于10％(g/v)的氢氧化钠溶液加入木质素(溶液中木质素含量不超过10g/L)，在80-100℃下处理1-6h。

6.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(1)所述的金属催化剂裂解方法：以金属催化剂(镍、钛、锌等)为催化剂，在10％的木质素溶液体系中100-300℃下处理0.5-1h；将木质素以1-10％(g/L)的浓度溶解于2-10％NaCl溶液当中，然后在反应釜中60-200℃反应1-3小时后收集滤液备用。

7.根据权利要求2所述的一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，其特征在于其中步骤(2)2216E培养基成分如下：蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠19.45g/L，氯化镁5.97g/L，硫酸钠3.24g/L，氯化钙1.8g/L，碳酸钠0.16g/L，溴化钾0.08g/L，氯化锶0.034g/L，硼酸0.022g/L，硅酸钠0.004g/L，氟化钠0.0024g/L，硝酸钠0.0016g/L，磷酸二氢钠0.008g/L。