[发明专利]转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用

说明书

本发明公开了转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用，属于生物技术领域。该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(Bacillus ligniniphilus)L1‑vdh,其已于2020年1月保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CGMCC No.19226。本发明将嗜木质素芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)的香草酸脱氢酶的编码基因敲除使该基因失活的方法大量蓄积香草醛。从而实现从木质素到香草醛的转化。应用本发明可以将含有木质素类生物质及其解聚产物转化为香草醛。本发明能够将农林废弃生物质资源例如木屑和秸秆以及工业木质素、造纸黑液等廉价物质转化为高附加值的芳香化合物香草醛，解决了农林废弃物的高值化利用瓶颈，具有重要的环境保护意义。

技术领域

本发明涉及利用分子生物学技术，通过重构嗜木质素芽孢杆菌菌株的代谢途径获得能够大量蓄积香草醛的嗜木质素芽孢杆菌基因工程菌(以下简称基因工程菌)，实现将含木质素类生物质或者工业木质素及它们的解聚产物转化合成香草醛的方法，属于生物技术领域。

背景技术

香草醛(Vanillin，C₈H₈O₃)，学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香兰素，是世界上产量最大、用途最广的广谱型高档香料，应用于食品、日化、橡胶、塑料和医药等行业。

化学合成方法合成香兰素是市场主要香兰素的来源，年产量已经高达20000吨，但是化学合成香兰素虽然成本低廉，规模大，但是容易造成环境污染，且不能满足人们对天然食品的要求。

天然香兰素目前主要通过香荚兰豆提取获得，但是由于香荚兰种植中需要人工授粉，劳动强度大，难以大规模种植。目前香荚兰的种植量每年仅仅在2000-3000吨左右，提取的天然香兰素的产量仅仅20吨左右，市场售价高达3200美元/kg。近年来消费者对天然香兰素的需求越来越大，并且一些国外(例如欧洲)的立法机构，建议在食品中使用天然香兰素，但用植物组织提取的方法产率低、成本高、造成了天然香兰素的紧缺。

微生物降解转化木质素，具有转化法工艺简单，收率较高、能耗低、产品安全等优点。美国食品药品监督管理局规定“天然香料必须是来自于植物或动物的原料，经物理、酶法或者微生物加工过程得到的产品”。因此，微生物法转化合成香兰素，将是今后发展的重要趋势。

木质素作为全球最丰富的天然芳香化合物的主要来源，长久以来未得到重视和利用。如何将木质素成分转变为高值化产品是提高解聚木质素综合利用的一个可行途径。木质素解聚产物中含有大量的阿魏酸、肉桂酸、香草酸、香草醛和香豆酸等芳香化合物。通过生物方法将木质素中的芳香化合物转化为特定单一的芳香化合物，对实现木质素的高值化利用具有重要的现实意义，也是实现农林业可持续发展的要求。木质素化学降解分离纯化香草醛已经有不少相关报道，例如碱性条件下氧化解聚木质素后再提取分离获得香草醛，缺点是使用的催化剂主要为贵金属和过渡金属基催化剂，成本较高并且分离纯化困难，并且容易造成污染，因此很难得到工业应用。通过生物方法在温和条件下将木质素转化为香草醛，避免了使用催化剂和产生环境污染物，是未来利用木质素转化生产香兰素可行的方法之一。之前有报道构建的工程菌Rhodococcus jostii RHA045可以利用麦草秸秆和葡萄糖做原料生产香草醛，6天的发酵后可以达到96mg/L的产量(Paul D.Sainsbury,et al.ACSchemical biology,2013,8,2151-2156)。但是这株菌不能利用木质素做单碳源，使用碱性木质素做碳源发酵48-72小时，仅仅得到1.0-1.3g/L的香草醛，显然这株菌不适合利用木质素生产香兰素。而且6天的过长发酵时间也影响了香兰素生产的效率，所以难以实现木质素转化香兰素的生产。