[发明专利]一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用

权利要求书

1.一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)串扰系数测量：

将供体质粒和受体质粒分别转染细胞，然后分别进行E-FRET成像，获得三通道平均荧光强度I_DD、I_AA、I_DA，并计算得到串扰系数a，b，c和d；

(2)测量FRET质粒单独转染细胞的F_Ci-N/I_DDi-N比例值范围：

①将i种效率不同的FRET质粒分别单独转染细胞，待细胞贴壁后，从转染每种质粒的细胞中分别选取N个以上的细胞或区域进行E-FRET成像，分别获得转染第1种质粒的细胞或区域的三通道平均荧光强度I_DD1-1、I_DD1-2……I_DD1-N，I_AA1-1、I_AA1-2……I_AA1-N，I_DA1-1、I_DA1-2……I_DA1-N，并计算受体敏化荧光强度F_C1-1、F_C1-2……F_C1-N，再计算比值R，为R_1-1＝F_C1-1/I_DD1-1、R_1-2＝F_C1-2/I_DD1-2……R_1-N＝F_C1-N/I_DD1-N，然后根据转染第1种质粒的N个以上的细胞或区域的全部比值R，以0.01～0.1为区间间隔作统计直方图，根据结果选择峰值的半高宽度作为转染第1种质粒的细胞的比值范围R₁，或在统计直方图的峰值对应的R值的基础上加减0.01～0.1作为比值范围R₁，或根据最大值和最小值确定比值范围R₁；再采用相同的方法，分别获得转染第2种质粒至第i种质粒的细胞的比值范围，为R₂、R₃……R_i；其中，i≥2且为整数；N≥20且为整数；

(3)测量混合培养多种FRET质粒单转细胞的F_Ci′/I_DDi ′比例值：

将步骤(2)中的各种FRET质粒分别单独转染细胞，待转染的质粒表达成功后，将表达不同FRET质粒的细胞合并在同一个培养皿中培养，待细胞贴壁后选取m个以上的细胞或区域进行E-FRET成像，分别获得三通道平均荧光强度I_DD1′、I_DD2′……I_DDm′，I_AA1′、I_AA2′……I_AAm′以及I_DA1′、I_DA2′……I_DAm′，并根据步骤(1)中得到的串扰系数a，b，c，d分别计算得到受体敏化荧光强度F_C1′、F_C2′……F_Cm′，再计算比值R₁′＝F_C1′/I_DD1′、R₂′＝F_C2′/I_DD2′……R_m′＝F_Cm′/I_DDm′；其中，m≥5；

(4)细胞分类：

根据步骤(3)中得到的R₁′、R₂′……R_m′的大小，将其对应的细胞归类到步骤(2)的细胞类型中：如R₁′在R₁的范围内，即R₁′对应的细胞为转染第1种质粒的细胞，如R₁′在R₂的范围内，即R₁′对应的细胞为转染第2种质粒的细胞，如R₁′在R_i的范围内，即R₁′对应的细胞为转染第i种质粒的细胞；以此类推，分别将R₂′……R_m′进行归类；

(5)计算或拟合得到G因子、k因子和消光系数比γ：

根据步骤(4)的归类和步骤(3)中获得的数据，在i种质粒中至少选择2种以上质粒对应的细胞的平均荧光强度和受体敏化荧光强度，记为I_DD1″、I_DD2″……I_DDi″，I_AA1″、I_AA2″……I_AAi″，F_C1″、F_C2″……F_Ci″，对各种转染质粒的细胞或区域计算y₁＝F_C1″/(a×I_AA1″)和x₁＝I_DD1″/(a×I_AA1″)，y₂＝F_C2″/(a×I_AA2″)和x₂＝I_DD2″/(a×I_AA2″)……y_i＝F_Ci″/(a×I_AAi″)和x_i＝I_DDi″/(a×I_AAi″)，再以此计算G因子、k因子和消光系数比γ，分为如下两种情况：

当i＝2时：G＝(y₂-y₁)/(x₁-x₂)；k为每个细胞或区域的k因子的平均值；γ＝a/(G×k)；

当i2时，将以x₁，x₂……x_i为横坐标，以y₁，y₂……y_i为纵坐标，通过最小二乘法拟合得到一条直线，该直线斜率的绝对值为G因子，直线y轴截距的倒数为消光系数比γ，最后计算k因子，即每个细胞或区域的k因子的平均值。