[发明专利]一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用。该方法为先用串扰校正样本获得串扰系数a，b，c和d，然后将不同的FRET质粒分别单独转染细胞并进行E‑FRET成像，分别确定转染不同质粒的细胞的比值范围R；接着将各种FRET质粒分别单独转染细胞后混合培养并进行E‑FRET成像，获得相应细胞的比值R并进行细胞分类；最后根据细胞分类以及其对应的E‑FRET成像数据，计算或拟合得到G因子、k因子和消光系数比γ。本发明方法可以对实时采集到的细胞图像进行细胞分割和表达不同质粒的细胞分类，并根据细胞分类获得G因子、k因子和消光系数比γ，具有很高的稳定性和可靠性。

技术领域

本发明属于荧光共振能量转移(FRET)检测技术领域，特别涉及一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用。

背景技术

定量FRET显微术已经成为在活细胞中研究生化分子动态过程的重要工具。定量FRET检测技术不仅可以用于活细胞中分子结合与分离的实时动态研究，而且还可以用于活细胞中生物单分子结构信息比的测量。

基于三个滤光片组合的FRET显微成像术(简称3-cube FRET microscopy，E-FRET方法)。要求分别利用三个不同的荧光滤光片组对FRET样本得到三种图像：供体通道图像(I_DD，通过供体激发光激发时在供体荧光探测通道探测到的供体荧光)，受体通道图像(I_AA，通过受体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的受体荧光)，FRET通道图像(I_DA，通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光)。

系统矫正参数(G因子和k因子)以及供受体消光系数比(γ)是定量FRET检测的关键参量[Zal T,Gascoigne N R J.Photobleaching-corrected FRET efficiency imagingof live cells[J].Biophysical journal,2004,6(6):3923-3939；Butz E S,Ben-JohnyM,Shen M,et al.Quantifying macromolecular interactions in living cells usingFRET two-hybrid assays[J].Nature protocols,2016,11(12):2470-2498；Ben-Johny M,Yue DN,Yue DT.Detecting stoichiometry of macromolecular complexes in livecells using FRET[J].Nature communications,2016,7(1):1-0]。G因子表示的是敏化受体发射的荧光(F_c)占由于发生FRET使供体发生淬灭的荧光的比值；k因子表示的是在没有发生FRET的情况下相同摩尔浓度的供受体荧光强度的比值；消光系数比γ指的是受体-供体在供体激发波长处的消光系数之比【ε_YFP(λ_ex,D)/ε_CFP(λ_ex,D)】。对于一种给定的FRET荧光团对和成像系统，矫正参数和消光系数比是一个恒量。测量获得可靠的G因子、k因子以及消光系数比γ是定量FRET测量的关键。