[发明专利]猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂为三价融合型蛋白质，由产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素组成，其基因核酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于：其编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；其中包括3个核心抗原表位：表位1：LSPIAQDAKPVESPKEKIPLES，表位2：PAAKGCMKNLFIALMLIFSSIALSPTVENDT，表位3：DENGNLIDCCEICCHPAGSGVL。

3.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白开放阅读框与pGEX4T-1载体连接，所述三价融合蛋白开放阅读框的基因核酸序列如SEQ ID No：1所示，构建重组表达载体pGEX-LTB，转化BL21(DE3)感受态，筛选获得重组表达菌株BL21(DE3)-pGEX-LTB；

（2）重组表达菌BL21(DE3)-pGEX-LTB，LB培养基培养，在37℃，经IPTG诱导，超声波破碎，12000r/min，4℃，离心15min，收集沉淀蛋白；

（3）往沉淀蛋白中加入PBS缓冲液，漩涡振荡制备得到纯化的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白重组蛋白悬液。

4.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的抗体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂采用0.02%甲醛灭活36小时，用硫代硫酸钠中和1小时，与疫苗佐剂以1:1的体积比例混合，混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.1mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化0.5h；

（2）蛋鸡的免疫：对蛋鸡进行胸部肌肉注射步骤（1）处理后的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，剂量为1mL/只；依次于初次免疫后第14天和40天，进行第2次和第3次加强免疫；抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋，采用western blot方法检测LTB特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，采用PEG6000从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。

5.根据权利要求4所述的抗体制备方法，其特征在于：所述疫苗佐剂为GEL01、ISA71VG、PET01、氢氧化铝、矿物油中的一种或几种。

6.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的应用，其特征在于：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂经甲醛灭活后与猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株制备联合使用的药剂。

7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的应用，其特征在于：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂与猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株的混合比例为：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂5～20μg、猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株1头份，10^6.0TCID50。