[发明专利]一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

说明书

本发明涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK。该方法具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于复杂基质中蜂毒肽的准确定量，对保护蜂毒肽消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法。

背景技术

蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的毒液，它是蜜蜂蜇刺敌害时释放的一种生物武器。蜂毒中含有丰富的酶、多肽、生物胺、激素、有机酸、氨基酸等物质，其中蜂毒肽(蜂毒溶血肽)是蜂毒中主要成分，它占到干蜂毒重量的50%以上。蜂毒肽是由26种氨基酸组成的小肽类物质，呈α-螺旋构象，它具有广泛且强烈的生物学活性，如抗菌、抗炎、镇痛、免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等功效。目前，我国和全球多个国家均已批准蜂毒肽作为上市药物，用于治疗风湿性疾病和周围神经炎。近年来研究发现，蜂毒肽在皮肤保养和部分皮肤病防治方面疗效确切，它能刺激肌肤胶原蛋白产生，紧实提拉，抚平细纹，恢复弹性，从而使得蜂毒肽成为护肤品行业的新宠。目前，国内外已经有众多企业开展了蜂毒肽在护肤品中应用探索，并在市场上推出了各式各样的护肤产品，如蜂毒保湿水、蜂毒护肤霜、蜂毒面膜等。一只成年工蜂蜇刺时，分泌的蜂毒肽仅仅几十微克，足见蜂毒产量非常稀少，从而导致蜂毒肽原料价格非常昂贵。近年来，采用电击方式收获蜂毒的方法虽然有效的提高了蜂毒产量，即便是如此，蜂毒肽的价格仍然比黄金要昂贵许多。鉴于蜂毒肽的高昂的价格，护肤品中添加蜂毒肽会显著增加生产成本，从而导致标识蜂毒肽的护肤品价格显著高于普通护肤品。当前，我国并未颁布有关护肤等产品中蜂毒肽的含量测定标准，不同企业的生产方式和质控标准并不统一，产品中蜂毒肽含量的标识完全基于企业自律，从而导致市场蜂毒肽类护肤品的质量参差不齐，甚至出现了假冒伪劣的现象。因此，加快制定护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量分析方法已经成为养蜂业和护肤行业的共识。

当前，蜂毒肽的来源主要是来自规模化养殖的蜜蜂：意大利蜜蜂和中华蜜蜂，两者生产的蜂毒肽均是有26个氨基酸组成，且氨基酸序列完全一致，为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ（SEQ ID No.1）。当前常用的检测方法主要是通过液相串联质谱的技术定量测定完整蜂毒肽，检测其多电荷母离子及子离子进行定量。由于护肤品等产品中蜂毒肽的含量很低，仅处于痕量水平，而其基质又十分复杂，采用现有的分析方法，难以实现护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量。

发明内容

本发明提供的方法有效克服了现有蜂毒肽分析方法的弊端，通过检测酶解之后的蜂毒肽的特征肽段，实现了复杂基质中蜂毒肽的准确定量。该方法可以用于护肤品、牙膏、膏药等产品中蜂毒肽的定量分析，对保护蜂毒肽消费者的权利具有一定的现实意义，同时为后续蜂毒肽行业标准的制定提供了方法参考。

具体而言，本发明首先提供了一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下: VLTTGLPALISWIK（SEQ ID No.2），并通过Uniprot和NCBI数据库进行特异性验证。

作为优选，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z 756.46343([M+2H]²⁺)；子离子图谱中包含碎片离子m/z 927.56409、m/z 585.35938；其允许偏差应在10 ppm以内。

作为优选，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。