[发明专利]多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒

权利要求书

1.一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下三个耐药基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素2142AG、2142AC、2143AG，四环素926-928AGA，喹诺酮类Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；

所述与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.3所示序列；

所述与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.4所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.5所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.6所示序列；

所述与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQ IDNO.7所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.9所示序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、CY3、Red-X、TAMRA、ROX中的任意两种；荧光淬灭基团选自Dabcy1、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种或两种。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人类管家基因β-globin的引物对，其序列如下：

上游引物：5’- GTGCACCTGACTCCTGAGGA -3’ ，如SEQ ID NO.10所示序列；

下游引物：5’- CTTGATACCAACCTGCCCAG -3’ ，如SEQ ID NO.11所示序列；

所述人类管家基因β-globin的探针序列如下：

5’- AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -3’，如SEQ ID NO.12所示序列；探针的5’端标记HEX基团作为荧光基团，3’端使用BHQ1作为淬灭基团。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂中，裂解液为异硫氰酸胍、盐酸胍和柠檬酸三钠中的任意一种或多种；洗涤液为乙醇和/或胍盐；洗脱液为TE缓冲液。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括PCR缓冲溶液和盐溶液。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液为Tris-HCl；所述盐溶液为MgSO₄或KCl；按照反应体系25μL计算 ，限制性引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.10所示引物的浓度为0.01-0.1μM，过量引物如：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示引物的浓度为0.1-1μM，探针浓度为0. 1-0.2μM；DNA聚合酶1U/test-5U/test；PCR缓冲溶液包括：Tris-HCl的浓度为0.5mM-2 mM；KCl浓度为0.5mM-2 mM；Mg₂₊浓度为2 mM -5 mM；dNTPs浓度为2 mM -5mM。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；阳性对照品中含有所述三个耐药基因的突变质粒和野生型质粒，阴性对照品为含有人基因组的TE缓冲液。