[发明专利]多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒

说明书

本发明公开了一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，幽门螺杆菌耐药基因为以下3个基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因；试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；核酸扩增试剂包括：分别与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因、内标基因人类管家基因β‑globin对应的引物对和探针。本发明可在单管中同时检测三个耐药位点和1个内标基因，提高样本检测通量；同时改善检测体系中多对引物探针间的干扰，有效提高试剂检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，涉及一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒。本试剂盒用于胃粘膜组织样本中对幽门螺杆菌gyrA基因、23S rRNA基因、16S rRNA基因上常见耐药突变的定性检测，辅助临床治疗的药物选择。

背景技术

目前对幽门螺杆菌耐药的检测方法包括药敏检测、核酸测序、TaqMan实时荧光PCR法等。药敏检测为幽门螺杆菌耐药检测的金标准方法，可以直观确定幽门螺杆菌对何种抗生素具有耐药性；核酸测序法可以借助不同的测序引物对待测样本进行测序，通过对耐药基因核酸序列进行比对，评估耐药基因是否发生突变；TaqMan实时荧光PCR法借助荧光检测平台，实现分别对待测物各耐药基因的检测，可有效区分各耐药基因的突变方向。

现有技术存在的问题：

目前对幽门螺杆菌耐药检测的方法有多种，临床上使用较多的是体外药敏试验，即通过培养幽门螺杆菌与不同种类的抗生素进行体外培养从而确定其的最低抑菌浓度，从而判断是否对所测试抗生素具有耐药性。该方法大概可分为肉汤微量稀释法、纸片扩散法、E-test、琼脂稀释法等。纸片扩散法操作简单，价格较为低廉，但是缺乏可用的标准纸片浓度，没有标准的有效抑制直径，只能得到定性数据；肉汤微量稀释法操作较为繁琐，但能够得到细菌临床分离株对于抗菌药物的MIC值；琼脂稀释法是CLSI规定的检测幽门螺杆菌抗菌药物敏感性的标准方法，能够快速、准确得到临床分离株是否对某种抗生素具有耐药性，但是该方法操作繁琐，技术要求高，需要花费大量时间，常被用作评估其他方法的对照法或进行大样本的研究，不适合运用于临床个例；E-test法可测定连续的MIC值，且适合运用于幽门螺杆菌这种生产缓慢的细菌，操作简单，在临床标本的使用上比较方便，但价格较高、不易普及推广。

中国发明专利申请CN201610943701公开了一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒和方法，该专利是利用经过blocker修饰的引物对未发生突变的耐药位点进行封闭，然后利用ARMS引物针对突变的耐药位点进行扩增，通过ARMS引物对各耐药位点进行突变检测。在该检测过程中存在以下几方面问题：1、Blocker修饰的引物与扩增引物竞争与靶标结合，降低扩增引物与靶标的结合效率，导致灵敏度降低；2、ARMS引物检测原理是依靠个别碱基差异进行型别区分，因此会出现由于引物错配引起的假阳性结果，导致特异性降低；3、该体系中需要针对不同的突变位点需设置不同的ARMS引物和blocker引物，试剂成本会比较高，提高检测成本，增加病人的检测费用。4、检测一个样本的7个碱基突变方向，需要1个样本检测8次，以确定碱基是否发生突变，导致在临床检测中操作繁琐、检测通量低，检测费用高，不适于临床使用。