[发明专利]转氨酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点选自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一个或多个。具有上述至少一个突变位点的转氨酶突变体，其酶活性和/或稳定性大大提高。

本申请是基于申请日为2017年11月15日、申请号为201711131103.1、发明名称为“转氨酶突变体及其应用”专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件以及对非天然底物的催化能力低等问题。定点突变和饱和突变技术是酶分子进行改造的有效手段。

定点突变(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对的方法。通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构和功能的影响。在酶的理性设计中，采用定点突变方法可筛选得到催化活性、底物特异性和/或稳定性提高的突变酶。

饱和突变是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体的一种方法。此方法不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。饱和突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。而对于定点突变方法不能解决的这些问题，恰恰是饱和突变方法所擅长的独特之处。

ω－转氨酶(ω－TA)属于转移酶类，同其他的转氨酶类一样，催化一个氨基与酮基互换的过程。ω－转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，受到众多研究人员关注和重视。

3-氨基吡咯烷衍生物及其光学异构体是一种手性胺化合物，是合成大量手性药物或农业化学品的关键中间体。(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷是重要的具有光学活性的3-氨基吡咯烷衍生物。J.M.C1992,35,1764报道的以(R)-1-苄基-3-吡咯烷醇为起始原料，用五步反应制得(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷，其ee值为96％，合成路线如下：

该合成路线的起始原料价格较高，且合成工艺中使用了有害试剂叠氮化钠，对操作设备及人员安全、三废处理等要求较高，对环境的污染较大。但目前报道的利用生物酶生物催化不对称合成手性(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷的方法极少。

尽管目前也有报道，转氨酶可以作为生物催化剂，一步还原酮底物，制备高光学纯度的(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷。与传统化学方法相比，生物转化法的反应条件温和，避免了强氧化剂、强还原剂以及危险试剂的使用，条件温和，对环境污染小。

但是该生物转化法在工业生产的应用中，依然存在一些问题需要进一步解决，该方法中酶催化活性不够高效，其反应体系总体积为40-60ml/g底物，反应体系体积大，导致了生产批次和生产成本的增加，并且导致后处理过程中有机溶剂的用量大，会增加反应后处理的难度，给环境带来较大的负担。另外现有技术中多数以D-丙氨酸或L-丙氨酸或其盐做为氨基供体，在反应体系中还需要加入葡萄糖和GDH，甲酸铵和FDH等偶联辅酶体系。

因此，仍需要对现有的生物转化法进行改进，以提高转氨酶的催化特性，减少反应体系总体积，降低生产成本，减少环境污染。

发明内容

本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高其催化活性。