[发明专利]一种冷冻保护液及刺参精子超低温冷冻保存方法有效
| 申请号： | 202011022462.5 | 申请日： | 2020-09-25 |
| 公开（公告）号： | CN112075415B | 公开（公告）日： | 2021-08-31 |
| 发明（设计）人： | 张立斌;许帅;刘石林;林承刚;孙景春;孙丽娜;杨红生 | 申请（专利权）人： | 中国科学院海洋研究所 |
| 主分类号： | A01N1/02 | 分类号： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 | 代理人： | 李颖 |
| 地址： | 266071 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 冷冻 保护 刺参 精子 超低温 保存 方法 | ||
1.一种冷冻保护液，其特征在于：
所述冷冻保护液由自然海水、二甲基亚砜（DMSO）和葡萄糖组成，其中各自体积质量比为85mL~90mL：10mL~15mL：1.98g；
所述冷冻保护液由自然海水和二甲基乙酰胺（DMA）组成，按体积比为80mL：20mL；
所述冷冻保护液用于冷冻保存刺参新鲜精液，冷冻保护液与刺参新鲜精液的体积比为1:7。
2.按权利要求1所述的冷冻保护液，其特征在于：所述自然海水为用0.45μm滤膜过滤的自然海水；二甲基亚砜（DMSO）为纯度≥99.97%的二甲基亚砜，二甲基乙酰胺（DMA）为纯度≥99.97%的二甲基乙酰胺，DMSO和DMA都属于非质子高极性溶剂。
3.一种利用权利要求1所述的冷冻保护液的刺参精子超低温冷冻保存方法，其特征在于包括以下步骤
（1）精液获取：取处于繁殖期的刺参获得其精子，待用；
（2）精液与冷冻保存液混合：将刺参新鲜精液与冷冻保护液按1:7的体积比充分混合置于容器中；
（3）程序降温：混合后置于程序降温仪中，运行降温程序，降温程序为0℃下平衡5min，以15℃/min的降温速率降温至-80℃，-80℃下平衡5分钟，以20℃/min的降温速率降温至-180℃，平衡5分钟后取出，即实现刺参精子超低温冷冻保存。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于：将所述经程序降温后的精子容器放入液氮中长期保存。
5.按权利要求3所述的方法，其特征在于：所述冷冻保存刺参精子置于25℃水浴中解冻，轻轻摇动使温度均匀，约120S时待只剩少量固体立即取出，在空气中继续摇动使其完全融化；吸取冻精加入到激活剂中混匀，使刺参原精稀释总倍速达600倍，激活液配方是含5wt%胎牛血清的过滤自然海水。
6.按权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）刺参新鲜精液为将收集的精子经激活剂稀释600倍，检测精子收集活力大于90%的精子，待用。
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