[发明专利]一种制备C14脂肪酸的方法

权利要求书

1.一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：

(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；

(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；

(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；

(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；

(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4～0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8～1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000～10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；

(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的accA基因与载体的酶切方法为NcoI/BamHI双酶切，yneP基因与载体的酶切方法为NdeI/NotI双酶切。所述的载体为pET-30a或pQE80L，载体与基因片段按摩尔比为1∶(5～10)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)与步骤(4)中所述的热击转化温度均为35～45℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻保存温度为-80℃～-90℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的菌体的体积接种量为0.5～1.5％；含有抗生素的LB液体培养基中的抗生素为卡那霉素或氨苄青霉素；含有抗生素的LB培养基中的抗生素浓度为30～50μg·mL^-1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的发酵培养并诱导表达目的蛋白的培养条件、加入诱导剂后继续培养的培养条件和步骤(6)的发酵培养的培养条件均为：温度35～37℃，转速200～250rpm，pH6.5～7.5；步骤(6)中发酵培养上清液的时间为1.5～2.5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的诱导剂为IPTG。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的萃取剂为氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的体积比为(3～4):2；发酵液和萃取剂的体积比为1∶(2～4)。