[发明专利]一种制备C14脂肪酸的方法

说明书

本发明公开了一种制备C14脂肪酸的方法。通过构建含有共同表达乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的重组表达载体的工程大肠杆菌中而获得。本发明所提供的高效产C14脂肪酸工程大肠杆菌是BL21(DE3)。该合成路径条件温和，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，该方法为昆虫性信息素的生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。

技术领域

本发明涉及一种制备C14脂肪酸的方法，可作为生产斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期材料，以指导斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术研究，提高田间防治效率，减少化学农药使用，保护环境，带来巨大的经济和社会收益。

技术背景

长期以来，农药特别是化学农药一直是斜纹夜蛾防治的主要手段。传统农用化学品带来的问题日益突出，易产生抗药性，难以降解并累积毒性甚至产生致癌性，影响农业生态安全、农产品质量、人体健康。

昆虫性信息素防治方法具有较强的特异性、灵敏度高、无污染、安全性高等优势。到目前为止，昆虫性信息素都是通过化学方法合成的，其反应条件苛刻(无水无氧反应)，催化剂和有机金属试剂昂贵，工艺路线长大规模生产难，稳定性差，直接限制了昆虫性信息素的工业化生产。目前通过研究基因工程技术、微生物法发酵、体外酶催化合成生产性信息素的方法微乎其微。

C：14脂肪酸是生物法合成斜纹夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期原料，然而来自植物和其他微生物生产宿主的脂肪酸的生物生产,在很大程度上依赖于操纵严格调节的脂肪酸生物合成途径，并且合成的脂肪酸是不同链长(C6-C24)的脂肪酸混杂在一起，C：14脂肪酸含量较低，较难分离。

本发明立足于江苏省农业科技自主创新资金项目，通过构建工程大肠杆菌的方法生产C：14脂肪酸，通过在关键技术上的创新，实现卡脖子技术的突破。本发明可减少传统农用化学品使用，保护环境，带来巨大的经济效益和社会收益。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备C14脂肪酸的方法，为斜纹夜蛾性信息素的生物合成技术提供一种必不可少的前期原料，可改善其化学合成法带来的大量问题。

本发明的技术方案为：一种制备C14脂肪酸的方法，其具体步骤为：

(1)提取并克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accA与硫脂酶基因yneP；

(2)将克隆的accA基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，yneP基因与载体用相同的酶切方法进行酶切，将载体与基因片段按一定的比例连接，获得重组载体pET-accA与pET-TE；

(3)将构建好的重组载体pET-TE热击转化到大肠杆菌感受态细胞中，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序筛选获得阳性重组工程菌；

(4)再将pET-accA重组质粒热击转入一个含有pET-TE的大肠杆菌感受态细胞中，即获得了含有乙酰辅酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大肠杆菌；冷冻保存该菌株；

(5)挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至含有抗生素的LB液体培养基发酵培养并诱导表达目的蛋白，培养至OD600为0.4-0.6时，再加入诱导剂至其在培养基中的终浓度为0.8-1mmol·L-1，继续培养8-24小时，培养液在8000—10000rpm条件下，离心5—10分钟，取培养液上清液；

(6)发酵培养上清液，萃取，减压浓缩，收集分析产物。

优选步骤(1)中所述accA基因来源于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)基因组DNA，Genbank登录号为：2878570的序列。yneP基因来源于枯草芽孢杆菌ATCC23857基因组DNA，Genbank登录号为：2914242的序列。