[发明专利]重组腺相关病毒纯化方法

权利要求书

1.一种重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，对收集的病毒悬液进行至少两轮阳离子交换层析纯化，其中，在第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化中设置pH为7.3～8.3的上样液以吸附并去除病毒液中杂质蛋白；在第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中，设置pH为4.0～4.5的上样液以吸附rAAV病毒，再通过一定间隔的多pH梯度洗脱rAAV病毒，进行浓缩和Buffer置换后，收集滴度和纯度满足需要的梯度洗脱峰液，得纯化的腺相关病毒；在第Ⅱ轮纯化后，选定对应于pH5.48、pH5.72和/或pH5.86的洗脱峰液进行浓缩和Buffer置换，得rAAV纯品。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液为pH7.8的柠檬酸钠缓冲液。

3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的上样液的载液为pH4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化中的pH梯度洗脱依次采用pH5.31、pH5.48、pH5.72、pH5.86、pH 6.02、pH6.17的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

5.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，在所述第Ⅰ轮阳离子交换层析纯化过程中，其离子交换柱选择HiTrap SP HP或者分辨率较低的层析柱HiTrapSP FF 或HiTrap Capto S；第Ⅱ轮阳离子交换层析纯化的离子交换柱选择HiTrap SP HP或者分辨率更高的层析柱RSOURCE 15 S或RSOURCE 30 S，以进一步保证rAAV的纯度。

6.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒纯化方法，其特征在于，对所述洗脱峰液进行浓缩和Buffer置换的方法如下：

1）取100kDa截留分子量的超滤离心管，加入一定体积的PBS缓冲液后冰浴预冷5 min，然后4℃、2000 g条件下离心10 min，弃去离下液；

2）然后将对应的梯度洗脱峰液取一定体积加入超滤离心管，于4℃、2000 g条件下离心10 min，离心后弃去离下液；

3）重复步骤2）直至该洗脱峰所有液体全部加入超滤离心管离心通过滤膜；

4）然后向超滤离心管再加入一定体积的PBS缓冲液，于4℃、2000 g条件下离心10 min，至终体积1 ml，弃去离下液；

5）重复步骤4）两次，最后一次离心，需要调整离心时间，浓缩至需要的终体积。