[发明专利]重组腺相关病毒纯化方法

说明书

本发明涉及一种重组腺相关病毒纯化方法。其主要包括第Ⅰ轮高pH（7.3～8.3）下的除杂纯化和第Ⅱ轮低pH（4.0～4.5）下的病毒吸附及严格密集梯度洗脱的进一步纯化。SDS‑PAGE结果表明病毒纯化效果显著，第Ⅰ轮纯化除去了大量的蛋白杂质，第Ⅱ轮纯化也明显除去部分杂质；WB和电镜结果证明，纯化产物实为rAAV病毒且滴度满足需要，而且镜检表明包含基因的实心颗粒占比可达99%。本发明纯化方法简单方便、能有效去除空壳病毒，提高包含基因的实心病毒占比，且易于实现rAAV的大规模纯化，为rAAV相关的临床研究和药物开发奠定了基础。

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒纯化方法。

背景技术

近几十年来，随着基因治疗的有关研究不断升温，各种基因表达载体相继被开发和应用，主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体主要包括裸质粒和脂质体DNA复合物等。虽然非病毒载体安全性高，但是它们转染效率低，介导基因表达的时间短，无法满足临床基因治疗的要求，所以现已基本被遗弃。常用的病毒载体包括：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）和逆转录病毒。但是慢病毒会整合至宿主染色体进而带来可能的安全隐患，腺病毒自身免疫原性较强，容易引发机体的免疫反应，一定程度上阻碍了其临床应用，逆转录病毒因为随机整合至宿主基因组的隐患和只能感染分裂细胞的限制，目前主要应用于体外实验研究。

而AAV载体相比于其它病毒载体具有以下优势：①安全性好，迄今尚未在人和动物中发现与AAV相关的疾病，85%以上的人群血清为AAV衣壳蛋白抗体阳性；②AAV是以位点特异性的方式整合在宿主基因组的病毒，避免了随机整合导致宿主细胞基因突变的问题；③AAV的宿主范围广，不仅可以感染分裂细胞，还可以感染静止期细胞；④rAAV携带的外源基因可以在宿主细胞长期稳定表达；⑤免疫原性低，重组腺相关病毒载体（Recombinantadeno-associated virus，rAAV）去除了野生型AAV自身的Rep和Cap基因，并不编码会引起免疫反应的病毒蛋白；⑥不同类型的AAV具有不同的组织嗜性，针对特定的组织可以选择更具组织特异性的AAV类型作为基因载体；⑦AAV还具有较好的热稳定性和抗酸、碱及有机溶剂的特性，有利于AAV的纯化。以上的这些优点，使AAV载体成为最有前景且最受欢迎的基因表达载体，在基因治疗和药物开发中备受关注。

随着AAV生产和纯化方法的不断改进以及rAAV相关的动物实验、临床试验的不断开展，多种rAAV药物已被广泛应用于多种疾病的基因治疗。rAAV的基因治疗已经在很多疾病动物模型上获得成功，如Leber先天性黑死病、Duchenne肌营养不良症、血友病B和帕金森病等。随着人们对rAAV载体的深入研究，将来可能发现更多、更安全、特异性更强、表达效率更高的rAAV载体。无论是开展动物实验，还是临床试验，均需要大量符合生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）要求的高纯度、高滴度的rAAV病毒载体。而rAAV的规模化包装和纯化是制约rAAV载体药物研究快速发展的关键问题。

总体上，rAAV的包装技术目前已比较成熟，而当前限制rAAV基因治疗研究快速发展的主要问题在于rAAV的纯化。所以，rAAV的基因治疗亟需一种简单高效、节约成本、可规模化的rAAV制备和纯化方法，来推进rAAV载体药物的研究进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组腺相关病毒纯化方法，以解决腺相关病毒纯化工艺复杂、纯化效果难以满足需要，且制备成本居高不下的技术难题。

在纯化方法的选择上，由于目前发展成熟且使用广泛的密度梯度离心法不适合规模化生产，且操作要求高不易掌握；基于此，本发明研究路线选择了更适合规模化生产且操作相对简单的离子交换层析法进行rAAV的后期纯化，但是将常规的离子交换层析法直接应用于rAAV的纯化，则难以做到病毒空颗粒的分离以及病毒产量和纯度之间的平衡。