[发明专利]一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用，属于合成生物学技术领域。本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的法尼烯合成酶Fsso；构建不同拷贝数HMG1和甲羟戊酸途径全部基因强化法尼烯合成菌株，确认单拷贝和双拷贝HMG1最有利于法尼烯的持续合成积累；用GAL启动子同时控制HMG1和Fsso的表达可进一步提高法尼烯的积累量。本发明构建的法尼烯合成菌株基因操作简单，摇瓶发酵最高能够积累1.11g/L法尼烯。

技术领域

本发明涉及一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用，属于合成生物学领域。

背景技术

自然界中，法尼烯(farnesene)存在α-法尼烯和β-法尼烯两种倍型。农业上，法尼烯可以抵御害虫对庄稼的攻击；工业上，法尼烯因其高度疏水性和高密度储能性可以作为石油的替代品；医药业上，法尼烯可以用作合成维生素E的前体。法尼烯在植物中的含量很低，通过植物萃取需要消耗大量的人力和物力；通过化学合成难以获得单一倍型产物；微生物因其生长迅速、合成特异性强、底物成本低等优点成为法尼烯合成研究重点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最简单的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技术和内源性甲羟戊酸途径的存在使酿酒酵母成为了萜类化合物合成研究的热点。

为了提高甲羟戊酸途径提供萜类化合物合成前体的效率，有研究利用过表达HMG-CoA还原酶编码基因(HMG1)或者HMG-CoA还原酶活性区域编码基因(tHMG1)提高甲羟戊酸代谢途径限速步骤HMG-CoA还原酶的量。同时，也有研究利用过表达甲羟戊酸途径所有基因可以提高甲羟戊酸途径的代谢流，但到目前为止，没有出现阐述不同甲羟戊酸途径强化方式和法尼烯合成酶的表达对法尼烯合成影响的相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌。该酿酒酵母工程菌的构建为酿酒酵母倍半萜化合物平台菌株的构建提供了有效的策略。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso；所述的甲羟戊酸途径基因为HMG1、ERG20、IDI1、ERG10、ERG12、ERG13、ERG8和MVD1中的一种或多种；所述甲羟戊酸途径基因为单拷贝或双拷贝，所述整合表达使用GAL启动子(GAL10-GAL1)。

进一步地，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。

进一步地，所述酿酒酵母工程菌以pMD-19T simple为整合表达载体。

进一步地，所述Fsso的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述酿酒酵母工程菌在生产法尼烯中的应用。

进一步地，将上述酿酒酵母工程菌先在YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化；接种活化后得到的单菌落到YPD培养基中培养18-24h进行种子培养；取种子培养液接种到YPD培养基中进行发酵，生产法尼烯。

进一步地，所述种子液的接种体积比为1-5％；所述发酵的条件为28-32℃，200-220rpm，发酵50-100h。

有益效果：本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的法尼烯合成酶Fsso；构建不同拷贝数HMG1和甲羟戊酸途径全部基因强化法尼烯合成菌株，确认单拷贝和双拷贝HMG1最有利于法尼烯的持续合成积累；用GAL启动子同时控制HMG1和Fsso的表达可进一步提高法尼烯的积累量。本发明构建的法尼烯合成菌株基因操作简单，摇瓶发酵最高能够积累1.11g/L法尼烯。本发明系统比较了不同强化方式对法尼烯合成的影响，构建了一株法尼烯高效合成菌株，具有工业化应用前景。

附图说明